DESeq2与edgeR差异可视化对比教程 - 第2节
负二项分布模型：为什么是它？
做 RNA-seq 差异分析的第一步，你得知道计数数据长什么样。 说白了，RNA-seq 测到的基因计数是离散的，而且方差通常比均值大——这就是 过离散（overdispersion）。 如果用普通的泊松分布去拟合，你会发现 p 值小得离谱，假阳性一大堆。 我当年第一次跑差异分析时就踩过这个坑，结果老板让我重做…
所以 DESeq2 和 edgeR 都用了 负二项分布，它有两个参数：
- 均值（μ）——代表真实表达水平。
- 离散度（dispersion）——描述方差怎么随均值变化。
形式上看，方差 = μ + α·μ²，其中 α 就是离散参数。 这个“额外”的 αμ² 项就是过离散的来源。 两个工具在处理离散度估计上其实思路一致，但算法细节有差别，后面会讲。
标准化方法：median-of-ratios vs TMM
测序深度不同、文库组成不同，直接比原始计数没有意义。 你需要把不同样本拉到同一个“尺子”上。 DESeq2 和 edgeR 用了不同的标准化策略，这是它们最核心的差异之一。
DESeq2 的 median-of-ratios
原理：对每个基因，计算该基因在各样本中的计数与几何均值的比值，然后取所有比值的中位数作为该样本的缩放因子。 这样做的好处是：不受高表达基因的干扰，对低表达和零计数也比较鲁棒。 我个人的习惯是：当实验组之间组成差异较大（比如 treated vs control 中有很多基因关闭），median-of-ratios 会更稳定。
edgeR 的 TMM（Trimmed Mean of M-values）
TMM 核心思想：先选一个参考样本（通常是表达量中等的），然后计算其他样本相对于参考样本的 log2 倍数变化（M 值）和平均表达量（A 值），对 M 值进行“修剪”——去掉上下 30% 的极端值，再求加权平均值，最后得到缩放因子。 这个方法对高表达基因的异常倍数变化不敏感，适合文库大小差异大的情况。 有一次我处理肿瘤 vs 正常组织的数据，文库总量差了 3 倍，TMM 给的结果比 median-of-ratios 更平稳。
| 特性 | DESeq2 (median-of-ratios) | edgeR (TMM) |
|---|---|---|
| 缩放因子计算 | 每个基因比值的中位数 | 修剪后的 M 值加权平均 |
| 对极端值的敏感性 | 低（中位数天然稳健） | 低（修剪后加权） |
| 处理零计数的能力 | 好（比值跳过零） | 一般（需要过滤低表达） |
| 适用场景 | 组成差异大、重复数多 | 文库大小差异大、重复数少 |
plotMDS() 看一眼样本聚类，确认参考样本合理。
统计检验策略：差异表达判断
标准化之后，两组的均值有了可比性，接着就要判断差异是否显著。 这里 DESeq2 和 edgeR 走了不同的技术路线。
DESeq2 的 Wald 检验与似然比检验
Wald 检验：直接估计组间倍数变化的标准误，然后计算 z 统计量。 速度快，适合简单两两比较。 似然比检验（LRT）：比较完整模型（含分组变量）和简化模型（不含分组变量）的似然值，适合多因素设计（比如 time + treatment）。 我建议你做时间序列或杂交设计时用 LRT，否则 Wald 足够用。
edgeR 的精确检验与准似然 F 检验
精确检验：直接用负二项分布计算两组计数的精确 p 值，适合两组比较，对小样本很友好。 准似然 F 检验（QL F-test）：在精确检验基础上引入准似然色散（quasi-likelihood dispersion），对离散度估计更保守，尤其适合有技术重复或批次效应的数据。 我的经验：如果你只有 2~3 个生物学重复，用精确检验更容易出结果；如果重复数 ≥ 4，QL F-test 更稳健。
# DESeq2 的 Wald 检验示例
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "control"))
# edgeR 的精确检验示例
fit <- exactTest(y, pair = c("control", "treated"))
top <- topTags(fit)你想想看，两个工具底层统计模型一样（负二项分布）， 但标准化和检验方式的不同，直接影响了最终的差异基因列表。 实际项目中，我常常两个都跑一遍，取交集或者分别验证，毕竟没有绝对的“最优”。