第二讲 空间转录组技术：10x Visium、Slide-seq、MERFISH 等主流技术原理

空间转录组技术，说白了就是给基因表达数据装上 GPS。有了它，我们不再只看一堆细胞混在一起的平均值，而是能知道每个基因在哪类细胞、哪个组织区域里说话。我个人习惯把这三大类技术分开理解：基于原位捕获的（10x Visium、Slide-seq）、基于单分子成像的（MERFISH），还有基于原位测序的（SeqFISH 等）。这节课我带大家把它们的原理、分辨率、通量这些核心参数捋一遍。

1. 10x Visium —— 组织切片上的“像素级”捕获

先说说我最早接触的 Visium。它的前身是 Spatial Transcriptomics 技术，后来被 10x 收购并做了商业化改进。你想想看，它就是一块载玻片，上面规则排布着许多捕获点（spots），每个 spot 直径 55 微米，中心距 100 微米。每个 spot 表面固定着带位置条形码（barcode）的 poly(dT) 引物。

工作流程大致是这样：

1. 将冰冻或 FFPE 组织切片贴在 Visium 玻片上，进行 H&E 染色并成像。
2. 组织透化，释放出的 mRNA 扩散到相邻的捕获 spot 上，与 poly(dT) 结合。
3. 反转录生成 cDNA，这时每个 cDNA 分子都带上了 spot 的位置 barcode。
4. 建库测序，通过 barcode 把 reads 定位回原始组织图像。

关键参数：

2. Slide-seq —— 磁性玻璃珠上的“超分辨率”空间捕获

Slide-seq 是 Mcarroll 实验室推出的技术，后来有 Slide-seqV2 改进版。它的核心是成千上万个磁珠（beads），每个磁珠直径约 10 微米，表面同样固定着位置 barcode 和 poly(dT)。这些磁珠随机铺在玻片上，形成“单珠精度”的捕获阵列。

为什么说它是超分辨率？因为 spot 密度远超 Visium。每个磁珠捕获 mRNA 的范围大约是 10 微米，定位精度可达亚细胞级别。但也因为它随机铺排，需要靠 in situ sequencing 或 SEM 成像来确定每个珠子的坐标。

工作流程：

1. 磁珠随机铺在玻片上，通过原位合成 barcode 给每个珠子上“身份证”。
2. 组织切片贴在磁珠层上，透化后 mRNA 扩散到最近的磁珠。
3. 磁珠用磁铁回收，建库测序，通过 barcode 反推位置。

与 Visium 对比：

3. MERFISH —— 显微镜下“点名”每个 RNA 分子

MERFISH（Multiplexed Error-Robust FISH）走的是完全不同的路线。它不是靠捕获扩散的 mRNA，而是直接在组织切片上对单个 RNA 分子进行成像。它利用组合标记和连续多轮 FISH 成像，把每个基因的编码信号解码出来。

原理核心：每个基因分配一个由 16 个 1/0 组成的“条形码”（每轮成像中，该基因被光点亮则记为 1，否则为 0）。通过 ~9~16 轮成像，就能同时识别几百个基因。为什么需要纠错？因为实际成像会有噪声，MERFISH 用汉明距离编码让部分读错也能纠正回来。

流程简述：

1. 制作几百个基因的特异性探针池，每个探针上带有编码位点。
2. 将探针杂交到组织切片上，进行连续轮次成像。
3. 解码图像，得到每个 RNA 分子的空间坐标和基因身份。

关键参数：

三种技术选型建议

你想想看，没有一种技术能通吃所有场景。我的经验是：

• 需要全转录组（万级基因）且不求单细胞精度： 选 Visium。适合肿瘤异质性、组织区域标注等探索性研究。
• 追求单细胞/亚细胞分辨率，但只关注数百个目的基因： 选 MERFISH。它定量准、可重复，适合神经环路、发育图谱等精细空间分析。
• 想要全转录组又不想放弃近单细胞分辨率： 可以考虑 Slide-seq（或 Slide-seqV2），但得接受数据稀疏性和更复杂的分析流程。

有时候还需要组合使用：比如用 Visium 先扫全切片锁定感兴趣区域，再用 MERFISH 对该区域做高精度成像。我在一篇肝癌空间图谱的项目中就这么干过，效果不错。