第二章：单细胞转录组数据预处理——QC、标准化、聚类
拿到单细胞数据之后，第一件事不是急着做通信网络图。你想想看，原始数据里的细胞状态良莠不齐，有死细胞，有双细胞，还有一大堆技术噪音。我刚开始做单细胞分析时，就吃过这个亏——直接跑下游分析，结果出来一堆假阳性，排查了半天才发现是质控没做好。
所以，咱们先把地基打牢。这一章我会带你走完预处理的三板斧：质控（QC）、标准化、聚类。每一步我都会给些实际项目里的注意点，帮你少走弯路。
1. 质控（Quality Control）——剔除垃圾细胞
质控的目标很明确：把低质量的细胞、双细胞、空液滴踢出去。常用的指标有三个：
- 基因数（nFeature_RNA）：一个细胞里检测到的基因数量。
- UMI总数（nCount_RNA）：唯一分子标识的总量。
- 线粒体基因占比（percent.mt）：线粒体基因的UMI占总UMI的比例。
为什么看这三个？我解释一下：
- 基因数太低 → 可能是空液滴或细胞破裂。
- 基因数太高 → 很可能是双细胞（两个细胞被抓在一个液滴里）。
- 线粒体占比高（比如>20%）→ 细胞膜受损，胞浆内容物漏出，只剩线粒体基因还在。
我的经验：阈值没有标准答案。10x Genomics 官方指南建议线粒体占比控制在20%以下，但不同组织差异很大。我在做脂肪组织样本时，线粒体占比普遍偏高（15%~25%），硬切到20%会丢掉一半细胞。稳妥的做法是先画分布图，再根据拐点定阈值。
具体操作，以 Seurat 为例：
library(Seurat)
pbmc <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
# 计算线粒体基因比例
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
# 画图看分布
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
# 质控过滤
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
特别注意：我曾经踩过一个坑——过滤条件里写了 nCount_RNA 的下限，结果把所有低 UMI 的细胞都清掉了，后来发现这批数据本身就是低启动率（比如10x v2试剂）。后来我改用 nFeature_RNA 加 percent.mt 做主筛选，nCount 只用来剔除极低值的异常点滴。
2. 标准化（Normalization）——消除技术差异
质控完，数据还是原始的 UMI 计数矩阵。不同细胞捕获效率不一样，测序深度也不同，直接拿原始计数比较会出问题。标准化就是为了把细胞拉到同一水平线上。
主流方法有几种：
| 方法 | 原理 | 适用场景 |
|---|---|---|
| LogNormalize | 每个细胞的总UMI归一化，再log变换 | 快速入门，Seurat默认 |
| SCTransform | 正则化负二项回归，处理方差关系 | 高噪音数据，推荐 |
| scran deconvolution | 利用临近细胞池估计尺度因子 | 低表达基因较多的数据 |
我个人习惯先用 SCTransform。它比 LogNormalize 能保留更多生物学变异，而且把标准化和找高变基因一步完成了。不过注意，SCTransform 对内存消耗较大，如果你的数据超过10万个细胞，还是用 LogNormalize 加 ScaleData 吧。
# SCTransform 标准化（Seurat v5）
pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)
标准化之后，记得做一步 ScaleData（如果用了 LogNormalize），把每个基因的表达量中心化并缩放，让后续PCA不受高表达基因主导。
核心认知：标准化不是“标准化数据本身”，而是让细胞之间可比，消除测序深度差异。不要在这个阶段过度缩放，否则会损失真实的表达差异。
3. 聚类（Clustering）——给细胞分群
标准化之后，我们要对细胞进行无监督聚类，找到不同的细胞亚群。这一步直接影响后续通信分析的细胞类型分配，必须做扎实。
Seurat 的聚类流程通常是：
- PCA降维 → 提取主成分，减少噪音。
- 选择主成分数 → 用 Elbow Plot 或 JackStraw 确定维数。
- 构建KNN图 → 基于PCA空间计算细胞间距离。
- Louvain/Leiden聚类 → 图算法划分模块。
# PCA
pbmc <- RunPCA(pbmc, npcs = 30, verbose = FALSE)
# 确定主成分数（看肘部图）
ElbowPlot(pbmc, ndims = 30)
# 聚类（分辨率参数控制分群粒度）
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:15)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
# UMAP 可视化
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:15)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE)
分辨率怎么调？ 没有固定公式。我一般先从0.5开始，看UMAP图，如果分群太粗（比如B细胞和T细胞混在一起），就提高到0.8~1.0；如果出现过多小群（看起来像噪音），就降到0.3~0.4。另外，可以试试 clustree 包，它能在不同分辨率下展示聚类的稳定性，非常有帮助。
聚类完成后，别急着走。我建议先用已知的 marker 基因验证一下分群的生物学合理性。比如免疫细胞数据，检查 CD3D（T细胞）、CD14（单核细胞）、MS4A1（B细胞）是否分配到了正确的群。这一步能快速发现因为批次效应或聚类参数不合理导致的分群错误。
避坑： 不要只用 resolution=0.5 就跑完全程。不同组织的最优分辨率差异巨大。我记得在分析肿瘤样本时，0.5分辨率把肿瘤细胞和正常上皮细胞分在同一个群，后来提高到0.8才把恶性克隆单独分出来。所以，多跑几个分辨率，结合生物学知识做判断。
知识框架一览
下面这张图把本章的核心流程串起来了——从原始计数到聚类分群，每一步的关键操作和产出物都在里面。
总结一下预处理的关键点
- QC 阶段不要死套阈值，一定要结合数据分布和生物学背景。
- 标准化选 SCTransform 能省事，但注意内存；大项目用 LogNormalize + ScaleData。
- 聚类分辨率是用 “生物学验证+统计稳定性” 双重标准确定的，不是找个神奇数字。
- 跑完聚类，记得用 marker 基因验证一下，别让后面的通信网络建立在错误的分群上。
好了，数据预处理到这基本就稳了。下一章我们会进到细胞类型注释，那是连接预处理和通信分析的桥梁——你得给每个 cluster 贴上生物学名字。
（注意：本章内容仅供教学参考，实际分析请根据数据特点灵活调整。）