4、实验设计与样本分组：标记策略选择
做定量蛋白质组学，第一步不是调 MaxQuant 参数，而是想清楚你的实验怎么设计。我自己吃过这个亏——上来直接跑 pre‑scan，结果分组乱了，最后统计时发现组间没法比，白白浪费两个月。所以这一节，咱们先把标记策略和分组方案聊透。
4.1 四大主流标记策略
目前最常用的定量策略就四种：Label‑free、TMT、iTRAQ、SILAC。你选哪个，直接决定了样本制备流程、仪器时间、数据分析难度。我习惯从三个维度去权衡：通量、精度、成本。
| 策略 | 原理 | 通量 | 定量精度 | 成本 | 常见场景 |
|---|---|---|---|---|---|
| Label‑free | 直接比较 MS1 峰面积或谱图数 | 任意样本数 | 中等 | 低 | 大规模筛选、预实验 |
| SILAC | 细胞培养时掺入稳定同位素标记的氨基酸 | 通常 2‑3 个比较组 | 高 | 中等（但培养周期长） | 细胞水平的精细定量 |
| TMT | 肽段标记后合并，MS2 报告离子定量 | 10/16/18 多重 | 高 | 中高 | 多组比较、临床样本 |
| iTRAQ | 原理类似 TMT，但标签结构不同 | 4/8 重 | 中高 | 中 | 少量样本的精细定量 |
我个人经验：如果你刚开始做一个新物种或新处理，先走 Label‑free 试试水。因为它不需要额外试剂，跑坏了也就浪费 DDA 时间。但假如你已经有稳定的建库流程，而且一次要对比超过 8 个条件，TMT 能把样本合并处理，大大减少总机时。
小提示： Label‑free 的定量重复性很大程度上依赖 LC‑MS 的稳定性。如果你仪器上的柱压或保留时间漂移超过 5%，就算你用 MaxQuant 的匹配色谱峰功能也救不回来。所以建议每个批次之间加一个 QC sample 做漂移校正。
4.2 分组方案的核心逻辑
分组这事，说白了就是怎么把你的样本塞进 MaxQuant 的 Experimental Design 表格里。你可能觉得“对照组、处理组、时间点”列清楚就行了，但这里有几个坑我踩过。
- 生物学重复 vs 技术重复： MaxQuant 的
Fraction列是用来区分同一个样本的不同馏分或者同一个肽段的多针进样。千万别把生物学重复当成 fraction 写进去了，否则软件会强制合并，相当于你把 3 个独立的生物学重复当作 1 个样本的三次进样，统计结果全毁了。 - 组内方差评估： 我建议每个条件至少 3 个生物学重复。少于 3 个，后续用 LFQ 或 TMT 的 p‑value 计算基本不可靠。如果你样本实在有限（比如稀有组织），那至少也要 2 个，然后在下游分析中用
ProteinGroup.txt里的Intensity列做手工 t‑test，但结果要审慎对待。 - 批次效应处理： 如果你的实验分了多天完成，或者换了色谱柱、换了流动相批次，必须把 batch 信息写进 MaxQuant 的
Batch列。虽然 MaxQuant 不会自动校正，但你在后续用 Perseus 做批次移除时，这些信息是必须的。
# ExperimentalDesignTemplate.txt 示例（Tab分隔）
File Condition Batch Fraction TechRep
sample1 Control B1 1 1
sample2 Control B1 1 2
sample3 Control B1 1 3
sample4 Treatment B1 1 1
sample5 Treatment B1 1 2
sample6 Treatment B1 1 3
# 如果有不同批次，分开写
sample7 Control B2 1 1
sample8 Control B2 1 2
...
注意： 如果你用了 TMT 或 iTRAQ，MaxQuant 里不需要再手动写
Fraction 列了——因为多重标记的样本在 MS 级别已经是合并进针的。但你必须保证 Condition 列与 TMT 通道的对应关系正确。我见过有人把通道编号和条件写反，结果费了三天才发现。
4.3 标记策略与分组方案的关系
这里放一张图帮你理清整体决策流程。我自己做项目时经常拿着这张图跟团队对齐。
4.4 分组方案实际操作
在 MaxQuant 的界面上，你只要填好 ExperimentalDesignTemplate.txt 就够了。但有一些细节会影响最终定量结果。
- 如果你用 Label‑free： 千万打开 Match Between Runs（默认是开的）。这个功能会跨样本匹配相同的色谱峰来增强定量覆盖度。但要注意，匹配的窗口太宽会引入假正。我一般设置在 0.7 min 左右。
- 如果你用 TMT/iTRAQ： 在
Group列中，要把同一条合并且同一通道的样本标记成相同 Group。比如 16 重的 TMTpro，每个通道是一个独立样本，但 16 个样本属于同一个 batch 组。 - 时间系列/剂量梯度： 这种设计最容易让分析师头疼。我的建议是把时间点或剂量写进
Condition列，例如Time0h_Control、Time1h_Treatment。MaxQuant 不会帮你排序，但后期用 Perseus 或 R 做趋势聚类时，清晰的命名能省很多功夫。
我的一个真实教训： 有一次我做了 12 个 TMT 通道，却忘了在
ExperimentalDesignTemplate.txt 里指定 Fraction 列（虽然用不上），结果 MaxQuant 报了个奇怪的错误。其实模板里可以留空列，但列头名称必须严格匹配。我建议大家每次都从安装目录下拷贝一份模板文件来改，不要自己手敲列名。
4.5 不同策略下 MaxQuant 参数差异
选好策略后，MaxQuant 的某些参数会跟着变。下面这个表格是我自己常设的起点值。
| 参数 | Label‑free | SILAC | TMT / iTRAQ |
|---|---|---|---|
| Type | Standard（或 LCM） | SILAC (double/ triple) | Reporter Ion MS2 |
| Reporter mass list | 无 | 无 | 根据试剂盒选择（如 TMT10 126‑131C） |
| Match Between Runs | 推荐开启 | 推荐开启 | 通常关闭（除非不同 batch 有相同标记） |
| LFQ | 开启（LFQ min ratio count 2） | 可不开启（用 ratio H/L） | 关闭（用 Reporter intensity） |
| Digestion mode | Trypsin/P etc. | Trypsin/P etc. | 与 Label‑free 一致 |
| Grouping | 按 Condition 分组 | 按 Condition 分组，同时要指定 Light/Heavy 链 | 按 Condition 分组，各通道独立 |
我这里多说一句关于 SILAC 的事。很多人觉得 SILAC 过时了，其实在细胞模型里它的定量波动最小，因为你从培养开始就标记好了。不过它只适合细胞，组织和体液的样本没法做。如果你要做多时间点且样本量可控的细胞实验，我建议优先考虑 SILAC。
避坑： TMT 和 iTRAQ 的 Reporter Ion 强度与母离子纯度密切相关。如果你用 MaxQuant 处理 TMT 数据，切记在
Andromeda 参数页打开 Reporter ion isotope correction。这个纠正系数如果不加，TMT 的定量会被邻近通道的信号“串扰”，尤其是高丰度蛋白。我刚开始用 TMT 时就栽在这个坑里，看结果还以为处理组里某个蛋白表达量异常，一查原来是同位素污染。
4.6 小结操作清单
在你真正点下 MaxQuant 的 Run 按钮之前，按这个清单过一遍：
- 定策略： 根据样本数量、精度要求和可操作性选择 Label‑free / SILAC / TMT / iTRAQ。
- 配分组文件： 确保每个样本有唯一文件名，ExperimentalDesignTemplate.txt 里 Condition、Batch、Fraction 列填写正确。
- 检查通道对应关系： TMT/iTRAQ 的通道编号与 Condition 一一对应，不要搞混。
- 设置匹配参数： Label‑free 打开 Match Between Runs，TMT 关闭它并打开 Isotope Correction。
- 至少 3 个生物学重复： 如果不足，就要在下游统计中更小心。
- 备份原始文件： 这是终极保险——我就有一次跑完发现分组写错，幸好 raw 文件还在，重新调整 ExperimentalDesign 就解决了。