MaxQuant 工作流程详解

说实话，很多人把 MaxQuant 当成一个黑盒子——点一下运行就等结果。但真正用它做过大规模 DIA 或者 TMT 项目的人都知道，同一个 RAW 文件，参数设不对，搜库结果能差出好几倍。我刚开始摸索那会儿，就吃过这个亏。

MaxQuant 的工作流程，说白了就三大块：数据导入 → 搜库匹配 → 定量与质控。每一块都有不少坑，我一个个讲到位。

原始质谱数据导入

这一步看似简单，但坑最多。MaxQuant 支持直接读取 Thermo RAW 文件（.raw）、Bruker 的 .d 文件夹、以及 mzXML 格式。我个人习惯用 Thermo RAW，因为转换少、保留的扫描信息最完整。

导入时，软件会自动做两件事：识别扫描事件和提取离子流。你不需要干预，但有几个参数得注意：

• Raw file location：路径不能有中文或特殊字符，否则加载会报错。我有一次因为项目目录带了个“&”，卡了半小时。
• First dimension mass accuracy：默认 4.5 ppm，对 Orbitrap 数据够用。如果你用的是 Q-TOF，建议放宽到 20 ppm，不然峰匹配不上。
• Top MS/MS per 30 s：默认 10。数据量大的 DIA 项目，我会调高到 15-20，但别开太高，不然假阳性飞涨。

Andromeda 搜库

搜库引擎 Andromeda 是 MaxQuant 的核心。它不是独立软件，而是嵌入在 workflow 里。搜库的质量，很大程度上取决于你给的数据库和参数。

这里我说几个关键点：

参数	推荐值	说明
Enzyme	Trypsin/P	允许 KR 前存在脯氨酸切割，更接近真实酶切
Max missed cleavages	2	超过 2 个漏切鉴定数会暴增，但假阳性也会
Peptide length min/max	7/25	太短或太长的肽段，匹配可靠性差
PSM FDR	0.01	严格 1% FDR，常用
Protein FDR	0.01	蛋白质水平 FDR，建议匹配

还有一点：搜库时的“Match between runs”功能。这个默认开启，但我不建议在数据质量差时用——它会强行对齐不同 run 的肽段，引入偏差。我一般的做法是：先不做匹配，跑一轮看结果，如果鉴定数太少，再尝试开启。

定量与质量控制

定量是用户最关心的部分。MaxQuant 支持两种模式：label-free（LFQ）和 isobaric labeling（TMT/iTRAQ）。我主要讲 LFQ。

定量过程的核心是提取肽段的 XIC（Extracted Ion Chromatogram）。每个前体离子在 m/z 和保留时间维度上找到峰面积。这里有个坑：“Minimum ratio count” 参数。默认是 2，意思是至少需要 2 个定量值才参与计算。如果样本质量差，很多肽段只出现一次，定量矩阵就会很稀疏。我会根据数据量调整：

• 如果样本组内重复性好，保持默认 2。
• 如果重复性差（比如临床样本），降到 1，但心里要有数——稀疏数据的结果需谨慎解读。

质量控制这一步，MaxQuant 会自动输出几个文件：

evidence.txt      # 所有肽段鉴定与定量信息
peptides.txt      # 肽段汇总
proteinGroups.txt # 蛋白质水平定量
summary.txt       # 基本统计信息

我个人习惯先看 summary.txt，里面包含每个 RAW 文件的鉴定数、定量数、MS/MS 谱图数。如果两个重复的鉴定数相差超过 20%，那很可能前处理有问题，我会先跑回质控实验室，而不是继续调参。

还有一个容易忽视的点：“Normalization”。MaxQuant 默认使用 LFQ 算法进行归一化，但对某些项目（比如除盐不彻底导致的偏移），我会手动勾选“Advanced normalization”或者在后续用 Perseus 做。总之，不要盲目信任默认参数。