📚 课程目录第1章 Visium技术原理

1、Visium技术原理

1.1 空间转录组学概述

我们讲空间转录组，到底在讲什么？过去几年单细胞RNA测序已经能测到每个细胞里的基因表达，但细胞一分离，它原本在组织里的「邻居关系」全丢了。肿瘤细胞旁边是免疫细胞还是成纤维细胞？这个位置信息，比表达谱本身还关键。空间转录组就是要把「什么基因在哪表达」这个问题落到组织切片上去。

按理说，做组织切片+原位杂交也能看到特定基因的位置，但通量太低，一次只能看几个基因。空间转录组能在一次实验里测到整个转录组（两万个基因左右），同时保留每一条转录本原本所在的组织坐标。说白了，就是给每个基因表达数据贴上组织里的「地理标签」。

我早年做单细胞时被问过最多的问题就是：你测出来这群细胞是搞免疫的，它们在肿瘤里是聚在一块还是散在组织里？单细胞回答不了。空间转录组就是来回答这类问题的。

一句话概括：空间转录组 = 单细胞分辨率（或近单细胞分辨率）的基因表达 + 组织原位坐标。

1.2 Visium技术流程

Visium是10x Genomics推出的空间转录组解决方案，继承了他们早期Space Ranger的技术路线，但做了大幅简化。我记得第一次用的时候拆开试剂盒，第一反应是「光学级盖玻片怎么这么贵」。整个流程分成5个关键步骤：

组织切片与贴片 – 把冷冻包埋的样品切成10μm薄片，贴到专用捕获玻片上。玻片上预先印着数百万个条形码位点，每个位点直径55μm，两两中心间距100μm。
组织透化与mRNA捕获 – 用蛋白酶处理组织，让mRNA从细胞里释放出来，扩散到下方的条形码探针上。透化时间要精确控制，透太浅收集不到RNA，透过了组织会塌。
反转录与二链合成 – 捕获的mRNA直接在玻片上进行反转录，cDNA被固定在条形码位点上。这一步空间信息就锁在探针的UMI和空间条码里。
文库制备与测序 – 把cDNA从玻片上洗脱下来加接头扩增，做成Illumina文库。测序读长不长，单端28+50或者双端都可以。
图像获取与数据对齐 – 贴片前先对组织切片拍一张明场或荧光图（H&E或者免疫荧光），然后通过自动配准把测序得到的空间条形码坐标和图像像素坐标对应起来。

这里面容易翻车的地方是透化。我曾经遇到一次某批切片贴上去后怎么都拿不到信号，最后发现是透化酶失效了。后来我养成了一个习惯：每次做新样品前先拿阴性对照切片试透化曲线，跑个预实验看看扩散半径够不够。

避坑指南：透化时间不是固定的。不同组织类型差异很大（比如脑组织耐透，肝脏很快），建议参考10x官方推荐条件再自己做3～4个时间梯度测试。

下面是整个流程的一张概览图，我把样品准备到数据分析的关键节点串在了一起：

1.3 基因表达与组织图像的关联

测序得到的东西其实是一张巨大的计数矩阵：行是基因（~两万个），列是空间条形码位点（每个位点对应55μm直径的组织区域）。同时我们还拍了一张组织切片的数字图像，像素清晰到能看到细胞核轮廓。

问题是怎么把这两者关联起来？Visium玻片上的每个捕获位点都印有唯一的空间条形码序列，在测序时可以直接从read里读到。同时，玻片制造时就已经把每个条形码的物理坐标（行、列）固化在了一个参考坐标系统里。我们只需要把那个参考坐标和显微镜拍摄的图像做个仿射变换，就能准确定位每个测序spot对应图像里的哪个像素区域。嗯，这一步实际执行时要小心图像畸变，我遇到过用FFPE样本时由于盖玻片不平整导致配准偏移了十几个像素，最后手工标记了几个landmark才纠正过来。

数据整合后的产物叫做「Spot-level 表达矩阵 + 空间坐标表」。下面是实际文件结构的简化示意：

# 表达矩阵 (matrix.mtx / h5)
基因 \ spot    ATCGAA-1   CGTGCT-1   ...
ENSMUSG00001   12         0          ...
ENSMUSG00002   0          8          ...
...

# 空间坐标表 (tissue_positions_list.csv)
barcode     in_tissue  array_row  array_col  pxl_row_in_fullres  pxl_col_in_fullres
ATCGAA-1    1          34         12         452                 1870
CGTGCT-1    1          34         13         568                 1870
...

这里 in_tissue 标记该spot是否在组织区域内（1=在组织上，0=背景），后面的行列号对应玻片上的物理位置，像素坐标对应全分辨率图像的像素。拿到这个表之后，你就可以任意画一张基因表达热图叠加在组织切片上了。

注意：不要直接用通孔号去对齐图像。不同扫描仪、不同分辨率的图像坐标是错的，必须用10x的Space Ranger或自写转换脚本将像素坐标换算到图像坐标系。我早期踩过这个坑，画出来的图错位了半个组织区域。

下表对比了常规单细胞转录组和Visium空间转录组的关键差异：

特性	scRNA-seq	Visium 空间转录组
空间位置信息	❌ 无	✅ 组织原位坐标
分辨率	单细胞	55μm spot（3～10个细胞）
通量（基因数）	全转录组	全转录组
组织类型	解离后细胞	新鲜冷冻 / FFPE 切片
下游分析难点	细胞聚类、差异表达	空间自相关、邻域分析、配准
典型应用	细胞异质性	组织结构与微环境

你想想看，有了几百到几千个spot的数据，每个spot都带一张小切片的图像特征，你就能做很多有趣的事：比如看某个基因在肿瘤边界区域高表达，在核心区低表达；或者根据图像形态学先圈出「坏死区域」再反查那里的表达谱。我个人觉得空间转录最迷人的地方就在这种「先看形态，再看基因」的工作流里。

一个小建议：刚开始接触Visium数据时先花半小时打开H&E图像，用肉眼找出几个明显的结构（比如脑皮层层、肿瘤坏死灶），然后对照表达矩阵看看经典marker基因（如NEUN、GFAP、CD3D）的空间分布，这样能快速建立「图像↔表达」的直觉。

总结一下：这一章我们建立了知识地基——空间转录组学是什么，Visium怎么做，以及最重要的「如何把基因表达和图像拧在一起」。后面我们会一步步深入实验数据预处理、降维聚类、空间反卷积等更具体的分析流程。