3、空间坐标与组织图像：解析spatial字段、H&E图像对齐

拿到一个Squidpy能用的Visium数据后，我最先做的事不是跑邻域分析，而是先看空间坐标和H&E图像有没有对齐。你想想看，坐标偏了一个像素，后面算出来的邻域关系全是错的。这章我们就来解剖一下spatial字段里到底装了啥，以及怎么把图像和坐标严格对上。

3.1 spatial字段到底长什么样？

在AnnData对象里，空间坐标藏在adata.obsm['spatial']。我每次打开新数据集，第一件事就是看它的shape：

import scanpy as sc
import squidpy as sq

adata = sq.datasets.visium_hne_adata()
print(adata.obsm['spatial'].shape)   # 通常是 (n_spots, 2)
print(adata.obsm['spatial'][:5])

打印出来你会看到两列数字，单位是像素。第一列是X，第二列是Y。注意⚠️ 这个坐标系的Y轴方向跟图像显示是反的——图像里Y向下增长，但这里Y向上增长。我早期没注意这个，直接画图发现点全跑到图像外面去了。

3.2 从像素坐标到真实物理坐标？别急

很多人以为spatial里面的坐标就是微米级真实坐标。翻车了。它只是图像上的像素位置。要换算真实距离，得靠adata.uns['spatial'][library_id]['scalefactors']里的信息。举个例子：

scalefactors = adata.uns['spatial']['V1_Human_Lymph_Node']['scalefactors']
print(scalefactors['spot_diameter_fullres'])  # 全分辨率下spot直径（像素）
print(scalefactors['tissue_hires_scalef'])     # 高分辨率图像相对于全图的缩放比

Visium的spot直径在全分辨图上大约是89像素，相邻spot中心间距约100像素。但不同组织样本的缩放因子不一样，千万别硬编码。我曾经有一个项目，跑了三天邻域分析，最后发现图像缩放因子用错了，所有距离都偏了20%，重头再来。所以我建议你在预处理阶段就把缩放因子存起来，一劳永逸：

adata.uns['spot_size_fullres'] = scalefactors['spot_diameter_fullres']
adata.uns['scalef_hires'] = scalefactors['tissue_hires_scalef']

3.3 H&E图像如何与坐标对齐？

这是新手最容易懵的地方。Visium官方提供的是全分辨率（fullres）图像和低分辨率（hires）图像。坐标默认是按全分辨率算的。但实际你更可能用hires来显示，因为全图太大。对齐的关键三步：

1. 读取hires图像：sq.datasets.visium_hne_image() 或自己加载tissue_hires_image.png
2. 缩放坐标：将spatial坐标乘以tissue_hires_scalef（注意不是除以！）
3. 翻转Y轴：因为matplotlib/imshow的Y轴从上往下，而空间坐标Y向上，所以需要y = image_height - y

代码实现：

import matplotlib.pyplot as plt
import numpy as np

image = adata.uns['spatial']['V1_Human_Lymph_Node']['images']['hires']
scalef = adata.uns['spatial']['V1_Human_Lymph_Node']['scalefactors']['tissue_hires_scalef']
coords = adata.obsm['spatial'] * scalef  # 缩放

# 翻转Y
h, w, _ = image.shape
coords[:, 1] = h - coords[:, 1]

plt.figure(figsize=(8,8))
plt.imshow(image)
plt.scatter(coords[:,0], coords[:,1], s=5, c='red', alpha=0.5)
plt.axis('off')
plt.show()

你会发现红色的spatial点完美覆盖在组织切片上。如果点全部漂移到图像外部或者只集中在某个角落，那就是Y轴翻转或缩放因子错了。

3.4 可视化比对：检查组织检测掩膜

除了手动画散点图，Squidpy提供了更专业的可视化工具sq.pl.spatial_scatter()。你看看：

sq.pl.spatial_scatter(adata, shape=None, color='total_counts', 
                      library_id='V1_Human_Lymph_Node',
                      img=True, img_channel=None)

这个函数自动处理了Y轴翻转和缩放，背后调用了我们刚才手动做的那一套。不过我还是建议你至少自己写一次原始坐标映射，这样出问题的时候能快速定位。

另外，adata.uns['spatial'][library_id]['images']['hires']里存的图像是RGB 8位无符号整型，最大值255。如果你要自己做图像处理（比如分割、染色分离），记得先归一化到[0,1]：

image_norm = image.astype(np.float32) / 255.0

3.5 SVG: 空间坐标与图像对齐流程

下面这张图把整个对齐路径画清楚了，我建议你收藏起来，以后做任何空间转录组项目都能复用这个流程。

3.6 常见坑与我的经验

• 坐标单位不一致： Visium是像素，但有些自有平台（如Slide-seq）给的是微米。记得先看文档。
• 全分辨图 vs hires： 如果你要自己算spot间的欧氏距离，必须用全分辨坐标，不能用hires缩放后的，否则距离单位乱了。
• 组织边缘的spot： 有时候tissue_hires_scalef是0.5，但实际hires图只有全图的一半大小，没问题。但偶尔官方数据包里有bug，hires图和fullres图的长宽比例不匹配（极少见，但我遇到过两次），这时候需要手动用PIL或cv2重新缩放。