3、空间转录组实验设计：样本制备、测序流程归纳总结
空间转录组实验，说白了就是把组织中每个位置上的基因表达信息都抓出来。这活儿听起来挺酷的，但做起来细节还真多。我自己带过的项目，有一半的失败都出在样本制备阶段。不是切片有冰晶，就是透化没控制好。所以这一章我把整个流程从样本到测序捋一遍，关键步骤和踩过的坑都摊开了讲。
3.1 样本采集与OCT包埋
样本一拿到手，最好立即处理。新鲜冷冻是金标准——先把组织切成小块（不超过5mm厚，不然冻不透），然后放进OCT里包埋。我个人的习惯是用异戊烷加干冰速冻，比直接丢液氮均匀得多，冰晶损伤也小。
这里有个大坑：OCT包埋时千万不能有气泡。气泡在切片时会留下空洞，导致后面捕获区域缺失。我曾经有一次没注意，切出来发现三张片子都有个大黑洞… 只能重来。
3.2 冷冻切片与组织固定
切片厚度一般控制在10–15 μm。太薄了细胞单层不完整，太厚了透化不均匀。我建议用低温恒温切片机，温度设在-20°C左右。切完后用粘附载玻片贴片，最好在切片周围用疏水笔画个圈，标记捕获区域。
固定我推荐4% PFA，常温15分钟。时间太长会让RNA交联过度，反转录效率会直线下降。嗯，这里要注意：固定后要马上用DEPC水洗掉残留的PFA，不然会影响后续酶反应。
3.3 透化与原位反转录
透化这一步是为探针打开通道。常用的有蛋白酶K或者HCL处理。但时间必须优化——不同组织差异很大。我遇到过脑组织10分钟就够了，肝脏却要20分钟。建议先用一张平行片子做预实验，用RNase-free的水检测透化深度。
反转录用的是带有空间条形码的引物。平台不同，捕获方式也不同。比如10x Visium用的是捕获spot的poly-dT探针，Slide-seq和HDST用的是微珠。你想想看，每个spot的条形码就是位置身份证，后面测序读数就靠它来定位。
小技巧：透化时间优化可以用台盼蓝染色观察组织切片上细胞核的穿透情况。我看到核变蓝了，就说明透化充分。
3.4 cDNA合成与文库构建
原位反转录完成后，要把cDNA从组织上释放下来。通常是加入Exonuclease I等酶把RNA模板消化掉，然后纯化。接着进行二链合成、扩增、打断、加接头等操作。说白了就是标准单细胞RNA-seq那套流程，只是模板量更少，所以扩增循环数要适当增加——我常用14–16个循环。
文库构建中的关键指标是cDNA产量。一般要求至少1ng才能上机。我曾经遇到过一批样本因为透化过度导致RNA降解，cDNA产量连0.1ng都不到，整个项目往后拖了两周。
注意：反转录酶不能接触酒精或高浓度盐离子，否则会失活。操作时戴手套，避免污染。
3.5 测序与质量控制
测序平台一般用NovaSeq 6000或NextSeq 2000，双端读取。读长要求：Read1一般28bp（包含UMI和barcode），Read2至少50bp（转录本序列）。我个人习惯用Space Ranger的spaceranger count做初步QC，先看看每个spot的UMI数量和基因数。
一个典型的QC命令如下：
spaceranger count --id=sample1 \
--transcriptome=/ref/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
--fastqs=/data/fastq \
--sample=mysample \
--image=/data/tissue_image.tif \
--slide=V10S24-006 \
--area=A1 \
--localcores=16 --localmem=64这里--slide和--area要跟实际玻片编号对应上，千万别写错，不然alignment会失败。
3.6 不同技术平台的样本制备对比
每种空间转录组技术的样本处理细节都不一样。下面这张表我整理了几种主流平台的差异，做项目选型时可以参考：
| 技术 | 组织处理 | 捕获方式 | 分辨率 | 通量 | 注意事项 |
|---|---|---|---|---|---|
| 10x Visium | OCT包埋，冷冻切片，固定透化 | 玻片spot上的poly-dT | 55 μm (spot间距) | 单张玻片5000 spots | 透化时间需优化；组织贴片要平整 |
| Slide-seqV2 | OCT或FFPE，冷冻切片 | 微珠阵列（10 μm珠子） | ~10 μm | 数万至数十万珠子 | 微珠需自行制备；数据量大 |
| MERFISH | 固定后爬片或切片 | 多重编码探针成像 | 单细胞级别 | 中等 | 需多轮杂交；光学系统要求高 |
| HDST | 冷冻切片到微孔板上 | 微孔捕获（barcode bead） | ~2 μm | 极高但覆盖率低 | 操作极复杂；成本高 |
经验总结：无论你选哪种技术，样本质量永远是第一位的。新鲜的OCT包埋块在-80°C可以存半年以上，但一旦切片贴在玻片上，最好两天内做完固定和透化。时间拖久了RNA会降解，数据质量直线下降。
这张图把整个流程串起来了。左边是样本制备阶段，核心目标是保持组织形态、保护RNA，同时让探针或微珠能接触到位。右边是文库构建和测序，跟常规单细胞RNA-seq没有本质差别，只是多了空间barcode的解析。
核心要点回顾：
- 新鲜冷冻比FFPE更适合大多数空转实验，RNA完整性是关键
- 切片厚度、固定时间、透化时间都需要根据组织类型做预实验优化
- 原位反转录步骤中温度和湿度要稳定，避免局部蒸发
- 文库扩增循环数不宜超过18，否则PCR重复会拉高噪音
- 测序数据QC阶段，重点看UMI多样性、barcode匹配率和mapping率
嗯，这一章基本覆盖了我做空转实验的血泪史。记住，好数据是设计出来的，不是跑出来的。样本制备阶段的每一个细节都直接决定后面分析的成败。