3、常见RNA-seq数据格式：FASTQ、SAM/BAM、counts矩阵、TPM/FPKM/RPKM

做RNA-seq模型验证，最怕什么？不是算法选不对，而是数据格式没搞懂。

我记得刚入行时，拿到一个10x的单细胞项目，同事扔给我一堆.bam文件。我直接当fastq读了……结果模型训了三天，出来的结果一塌糊涂。后来才发现，连数据是什么格式都搞错了。

所以这一章，咱们把RNA-seq常见的四种数据格式彻底讲清楚。你想想看，模型鲁棒性验证的第一步，就是确保你用对了数据。

3.1 FASTQ：原始序列的起点

FASTQ是测序仪直接输出的格式。说白了，它就是一段DNA序列，外加一个质量评分。每一个read都对应四行：

@SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

第一行是序列标识符（以@开头），第二行是碱基序列，第三行是分隔符（通常只有一个+），第四行是质量评分。

质量评分用的是Phred+33编码。每个字符对应一个ASCII码，减去33就是质量值Q。公式很简单：

Q = -10 * log10(P)
P = 10^(-Q/10)

Q30意味着碱基出错的概率是千分之一。我在项目中通常只看Q30的比例，低于80%的样本我会直接标记为高风险。

3.2 SAM/BAM：比对后的标准格式

把FASTQ比对到参考基因组后，得到的就是SAM或BAM文件。SAM是文本格式，BAM是它的二进制压缩版。

比对文件长什么样？看这段示例：

@HD	VN:1.6	SO:coordinate
@SQ	SN:chr1	LN:248956422
@PG	ID:bwa	PN:bwa	VN:0.7.17
read_1	0	chr1	10000	60	150M	*	0	0	ATCGTAGCTA...	IIIIIFFFFF...	NM:i:0	MD:Z:150

每行代表一条read的比对信息。关键的字段包括：

• QNAME：read名称，要和FASTQ里的@行对应
• FLAG：一个整数，用位运算表示比对状态（比如是否配对、是否唯一比对）
• RNAME：参考序列名称（比如chr1）
• POS：比对起始位置
• MAPQ：比对质量，类似Q值，越高越好
• CIGAR：比对时发生的操作，如剪接、插入、删除

我常被问到：“SAM和BAM到底该用哪个？” 答案是：存储用BAM，调试用SAM。BAM体积只有SAM的1/5，而且samtools处理起来快很多。

3.3 counts矩阵：基因表达的基本单位

把比对好的read映射到基因上，得到的就是counts矩阵。它是表达定量最原始的形式——每个基因有多少条read被检测到。

counts矩阵长这样：

gene_id	sample1	sample2	sample3
ENSG000001.1	125	98	134
ENSG000002.2	0	1	0
ENSG000003.3	2367	2100	2456

每一行是一个基因（用ENSEMBL ID或基因名标识），每一列是一个样本，每个单元格是整数。

注意，counts矩阵的特点是整数，且服从负二项分布。这是后续差异表达分析的基础。多数工具（比如DESeq2）直接吃counts矩阵。

生成counts矩阵的常用工具是featureCounts（subread包）和htseq-count。

featureCounts -T 8 -p -t exon -g gene_id \
  -a Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf \
  -o counts.txt \
  sample1.bam sample2.bam sample3.bam

这个命令会输出一个表格，包含每个基因在每个样本中的read计数。

3.4 TPM/FPKM/RPKM：归一化后的表达量

counts受基因长度和测序深度的影响，不能直接用来比较不同基因或不同样本的表达水平。所以需要归一化。

三种最常见的归一化方案：

指标	全称	归一化维度	特点
RPKM	Reads Per Kilobase per Million	基因长度 + 测序深度	最早出现，适用于单端测序
FPKM	Fragments Per Kilobase per Million	基因长度 + 测序深度	RPKM的双端版本，考虑fragment
TPM	Transcripts Per Million	基因长度 + 测序深度	先按长度归一化，再按比例缩放

它们之间的换算关系如下：

RPKM = (counts * 10^9) / (gene_length * total_reads)

FPKM = (fragments * 10^9) / (transcript_length * total_fragments)

TPM = (counts / gene_length) / sum(counts / gene_length for all genes) * 10^6

为什么我喜欢TPM？因为TPM在不同样本之间可比性最好。RPKM和FPKM对高表达基因有偏向，容易在跨样本比较时引入偏差。我在项目里，如果是做外部数据集评估，一律用TPM。

知识体系梳理

四种格式在RNA-seq流程中的位置和关系，我用一张图来总结：

从图中能清楚地看到数据流向：测序仪出来是FASTQ，比对后变成SAM/BAM，定量后得到counts矩阵，再从counts计算归一化指标TPM或FPKM。

我建议做模型鲁棒性验证时，保留三条路径：

• 路径A：直接使用counts矩阵做差异表达分析
• 路径B：用TPM做跨样本标准化后的比较
• 路径C：用FPKM做原始长度的校正（如果外部数据集只有FPKM）

为什么留三条路？因为外部数据集质量参差不齐。有的公开数据只给了counts，有的只给了FPKM。掌握了这四种格式，你就能灵活应对各种情况。