1. 单细胞RNA-seq简介

做单细胞RNA-seq分析这些年，我最大的感受就是：质控决定了你后面所有分析的可信度。要是你花了几万块做实验，结果因为清洗步骤没做好，最后发现大部分细胞都是空滴或死细胞——那种感觉，嗯，太心疼了。

这一章我们先把基础打好。聊聊单细胞测序到底做了什么，解决了什么问题，以及当下主流的平台长什么样。

1.1 技术原理

说白了，单细胞RNA-seq就是在单个细胞水平上测量基因表达。传统bulk RNA-seq只能看一群细胞的平均值，单细胞技术则能分辨出每个细胞的独特转录状态。

核心流程可以拆成几步：

1. 组织解离：把组织打成单细胞悬液。这一步很关键，如果细胞活力低，后面全白搭。
2. 单细胞捕获与标记：把每个细胞单独隔离，并给每个细胞赋予唯一的barcode（条形码）。
3. 逆转录与UMI标记：每个mRNA分子被打上唯一的UMI（Unique Molecular Index），用来消除PCR扩增偏差。
4. 文库构建与测序：构建cDNA文库，上机测序。
5. 数据清洗与质控：这是我们课程的重点——从barcode、UMI、基因表达矩阵中剔除低质量数据。

你可能会问：为什么要用UMI？我曾经在项目中遇到过一批数据，看起来表达量很高，但细查发现是PCR重复导致的——如果没有UMI去重，差异基因分析结果完全歪掉。

1.2 应用场景

单细胞RNA-seq的应用范围非常广。我简单列几个典型的：

领域	具体场景	我遇到的坑
肿瘤研究	描绘肿瘤微环境，识别稀有亚群	肿瘤细胞和正常细胞混在一起，质控门槛不一样，需要分层过滤
发育生物学	跟踪胚胎细胞分化轨迹	分化早期的细胞RNA含量极低，容易误判为低质量细胞
免疫学	分析T细胞、B细胞亚型及克隆性	免疫细胞的线粒体基因比例可能偏高，不能直接用统一阈值
神经科学	区分脑区不同神经元类型	神经元特别脆弱，解离过程容易大量死亡，活率必须严格监控
药物筛选	评估药物作用后的细胞异质性响应	细胞团块、多重细胞会严重影响统计，建议用DoubletFinder做双细胞剔除

1.3 常见平台

10x Genomics

10x是目前市场占有率最高的平台，它基于液滴微流控技术。很多朋友问我为什么选10x？就一个字：稳。它的GemCode技术能在一个液滴里同时完成细胞捕获、barcode标记和UMI添加。

一个典型的10x运行流程：

# 示例：使用Cell Ranger进行基本计数（版本7+）
cellranger count --id=mysample \
                 --transcriptome=/refdata/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
                 --fastqs=/path/to/fastqs \
                 --sample=Sample1

输出中最重要的文件是 filtered_feature_bc_matrix.h5，后续质控和质量过滤器都基于它。

我个人觉得10x最大的好处是：社区生态好，几乎所有单细胞工具都支持10x格式。坏处？嗯，试剂比较贵，一个样本成本上千美金。

Drop-seq

Drop-seq是McCarroll实验室开发的开放平台。它也用液滴，但barcode是通过“分割与混合（split-pool）”方式加载的，不像10x那样一次完成。

核心差别在于：

特性	10x Genomics	Drop-seq
barcode策略	每个胶珠一个独特barcode	通过组合合成实现（96×96）
UMI设计	15 bp随机UMI	12 bp随机UMI
捕获效率	通常5-10%	1-5%
通量	单次最多10万细胞	单次数千至1万细胞
成本	高（约$0.1-0.2/细胞）	低（约$0.01-0.05/细胞）
数据格式	Cell Ranger标准输出	自定义格式，通常由DropletUtils或STARsolo处理

还有一个平台叫Smart-seq2（全长转录本，基于plate），但因为通量低且没有UMI，现在主要用于稀有细胞或全长异构体研究。本章先不展开，后面遇到时再聊。

知识体系总览

下图帮你把本章核心脉络串起来：

从图上能看出来，质控是整个流程承上启下的关键——前面实验做得再好，原始数据里也一定混有气泡、死细胞、空滴或者多细胞。我们的工作就是把这些杂质清除干净，给下游分析提供一张干净的细胞-基因表达矩阵。