3. VCF质量控制：深度、质量、缺失率过滤

拿到一个VCF文件，别急着往下跑分析。先做质控。

QC的目的很单纯。把不可靠的变异位点干掉。把缺失太多的样本提出来。保证下游分析的数据底子干净。

这一章，我就把VCF质控最核心的三个指标讲透——深度、质量、缺失率。顺便聊聊我在实战里踩过的坑。

3.1 为什么QC这么重要？

VCF文件包含几十亿个位点的信息。但说实话，这里面有大量“噪音”。

举个夸张的例子。一个位点测序深度只有2x，这个变异是真是假？你没法判断。再比如，一个位点质量值(Qual)只有5，基本就是背景噪音。把这些低质量位点带进后续分析，结果大概率是错的。

我觉得很多初学者容易忽视这点——他们以为VCF就是金标准。其实VCF只是原始数据的“整理版”，不是“真相”。

3.2 深度过滤：DP (Depth of Coverage)

深度是VCF质控的第一道防线。它告诉你当前位点被测了多少次。

在VCF里，每个样本的深度信息一般存在FORMAT字段的DP里，有时也出现在INFO字段的DP(位点总深度)。

我个人习惯先看样本级的DP分布。你可以用bcftools快速统计：

bcftools query -f '%CHROM\t%POS[\t%DP]\n' input.vcf | head -20

然后我一般会给一个最低深度阈值。比如全外显子组数据，我习惯设10x。如果某个样本在某个位点的DP小于10，我会认为这个位点的基因型是不可靠的。

为什么是10？我曾经过过一个项目，把阈值从8降到5，假的变异位点一下子多出来15%。之后我再也没用过5x以下的阈值。

过滤命令也很简单：

bcftools filter -e 'FMT/DP < 10' input.vcf -o filtered_dp.vcf

这里要注意，FMT/DP是对每个样本单独过滤——某个样本深度不够，就只把那个样本标为缺失，而不是删掉整个位点。你要是用INFO/DP过滤，那是直接砍掉整个位点，区别很大。

3.3 质量值过滤：QUAL和GQ

QUAL和GQ是两个容易搞混的指标。我给你讲清楚。

• QUAL：位点的变异检测置信度。越高越可靠。
• GQ：某个样本基因型叫准的置信度。样本级别。

我一般会跟个规则：QUAL用INFO字段整个位点过滤，GQ用FORMAT字段逐个样本过滤。

QUAL的过滤阈值我习惯用30，对应99.9%的准确率。但你要是用GATK的VQSR做过后处理，QUAL可能不是主要过滤指标了——VQSR会重新给质量分数。

GQ的话，全基因组数据我设20，全外显子设30。为啥不一样？因为WES的捕获效率高，深度分布比较均匀，GQ偏高的比例多，阈值可以设高一点。

过滤命令示范：

# 位点QUAL过滤
bcftools filter -e 'QUAL < 30' input.vcf -o qual_filtered.vcf

# 样本GQ过滤
bcftools filter -e 'FMT/GQ < 20' input.vcf -o gq_filtered.vcf

3.4 缺失率过滤：MISSING RATE

缺失率是另一个容易被忽视的指标。它反映的是：在所有样本中，某个位点被成功基因型化(即不是./.或.)的比例。

为什么要关心缺失率？

如果某个位点有70%的样本都是缺失，说明这个位点本身就有问题——要么在基因组上的重复区，要么测序质量奇差。这种位点留着就是隐患。你在关联分析里加入这种位点，就是添乱。

我一般会给个阈值：缺失率≤20%，也就是至少有80%的样本覆盖到这个位点。

过滤逻辑是：先统计每个位点的缺失样本数，除总样本数，去掉超标的位点。

可以用bcftools配合awk来算：

bcftools view -e 'F_MISSING > 0.2' input.vcf -o missing_filtered.vcf

F_MISSING是bcftools自动计算的内置统计量——缺失样本比例。省得你手动数./.了。

1. 统计维度：位点级别(每个位点) 和 样本级别(每个样本)
2. 常见阈值：位点F_MISSING < 0.2, 样本缺失率 < 0.1
3. 我经历过一个极端案例：一个样本缺失率高达40%，查看后发现是DNA降解了。这种样本必须剔除。

3.5 实战流程：一个典型的QC管线

上面的三个指标单独讲是清楚的，但实际中你得一起用。下面是我常用的质控流程，你可以直接套用：

1. 预检： 查VCF基本统计。看总位点数、样本数、变异类型。命令bcftools stats input.vcf > stats.txt
2. 样本缺失率过滤： 剔除缺失率超过10%的坏样本。
3. 位点缺失率过滤： 去掉F_MISSING > 0.2的位点。
4. 深度过滤： 按样本DP<10设为缺失。
5. 质量过滤： QUAL<30砍位点，GQ<20砍单样本基因型。
6. 后验： 再跑一次bcftools stats，对比过滤前后的位点数、转换/颠换比(Ti/Tv)。

简单写成一个脚本就是：

bcftools view -e 'F_MISSING > 0.2' input.vcf | \
bcftools filter -e 'FMT/DP < 10 | FMT/GQ < 20' - | \
bcftools filter -e 'QUAL < 30' - > final_qc.vcf

这一套下来，一般80%的位点都能留下来，但假阳性基本都被干掉了。

3.6 常见QC指标速查表

最后给你一张速查表，日常做QC时对着看就行：