📚 课程目录第4章创建Seurat对象与初步探索

4. 创建 Seurat 对象与初步探索

数据读进来了，下一步就是把它变成一个 Seurat 对象。这一步看着简单，但里面有几个坑。我记得刚学单细胞时，直接把原始矩阵塞进 CreateSeuratObject，结果对象很大、过滤参数也没设，后面跑了一大堆没用的小基因。所以，这一节我把从读取到初步探索的完整流程拆开讲，每一步我都说说我的经验和避坑方法。

4.1 读取单细胞数据

最常见的是 10X Genomics 的 Cell Ranger 输出，一般是三个文件：matrix.mtx、barcodes.tsv、features.tsv（或 genes.tsv）。我用 Read10X 一步搞定：

library(Seurat)
counts <- Read10X(data.dir = "data/filtered_feature_bc_matrix/")

如果数据是 H5 格式，可以用 Read10X_h5；CSV 或 TSV 就直接用 read.table 读成矩阵，再手动构建。我个人习惯先用 Read10X，因为它自动把基因名和条形码对齐，出错少。注意，这里要确认你的数据是 filtered_feature_bc_matrix 而不是 raw，前者已经去掉了空液滴，后面质控就省一些事。

小提示： 有时候你拿到的数据文件夹里只有三个文件，没有子目录，那你把 data.dir 直接指向这个文件夹即可。如果报错找不到文件，先检查文件名是不是带后缀（比如 matrix.mtx.gz），Read10X 会自动解压 .gz，不用你手动解。

4.2 创建 Seurat 对象

拿到表达矩阵后，创建对象很简单：

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = counts,
                           project = "PBMC",
                           min.cells = 3,
                           min.features = 200)

这里有两个关键参数：min.cells 和 min.features。它们做什么的？

参数	含义	我的建议
min.cells	只在至少 N 个细胞中检测到的基因才保留	通常 3 个细胞，太大会丢掉一些稀有基因
min.features	细胞中至少要有 N 个基因表达才保留	200 是个常见起步值，低质量空细胞或碎片会被过滤掉

我刚开始做项目时，min.cells 用过 10，结果一些重要的低表达标记基因（比如某些 transcription factor）直接被扔了，后面聚类怎么都找不对。后来我老老实实用 3，基本不会误杀。

注意： 这两个参数只是粗过滤，真正的质控在后面用 QC 指标来做。这里不要过滤太狠，保持大部分细胞，后面再根据指标精细化剔除。

4.3 探索对象结构

创建完对象，先看看它长什么样：

pbmc
# 输出示例：
# An object of class Seurat 
# 13714 features across 2700 samples within 1 assay 
# Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)
#  2 layers present: counts, data

还可以用这些命令看看内部结构：

dim(pbmc)           # 基因数 × 细胞数
colnames(pbmc)      # 细胞条形码
rownames(pbmc)      # 基因名
head(pbmc@meta.data) # 元数据，包括 nCount_RNA 和 nFeature_RNA
pbmc[["RNA"]]$counts[1:5, 1:3]  # 原始计数矩阵切片

这里 nCount_RNA 是每个细胞的总 UMI 数，nFeature_RNA 是检测到的基因数。这两个指标是后续质控的基础，我建议你一拿到对象就先看看它们的分布。

4.4 添加线粒体基因比例

线粒体污染是单细胞数据里最常见的问题。细胞破裂后，线粒体 RNA 会残留在空液滴里，导致某些“细胞”的线粒体比例异常高。计算它：

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

这个函数会扫描基因名以 ^MT- 开头的基因（人类数据），求和后除以总 UMI。你也可以用 ^mt- 对小鼠，或者用特定基因列表。我遇到过一些数据，线粒体基因名是 MT-ND1、MT-CO1 这样的，用这个 pattern 刚好囊括。

关键点： 线粒体比例 > 20% 的细胞通常质量很差，后面要过滤掉。但不同组织类型阈值可以调整，比如脑组织可以放宽到 25%。

4.5 初步可视化探索

数据整理好了，用图看一眼整体质量。我平时必做两个图：小提琴图和散点图。

小提琴图：

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
        ncol = 3)

这张图能快速看出三个指标的分布。如果看到 nFeature_RNA 特别低的尾巴（比如 < 200），说明可能存在空液滴；percent.mt 如果有个别细胞飙到 50%、80%，那肯定有问题。

散点图：

FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

正常细胞应该呈正相关，因为 UMI 数高通常伴随更多基因被检测到。如果有些细胞 UMI 很高但基因数很少，那可能是技术噪音，比如扩增偏好导致少量基因占了大部分 UMI。反过来，基因数多但 UMI 低也有可能，但少见。

我记得有一次做肿瘤样本，散点图上出现一大团 UMI 极低、基因数却很“正常”的点，后来发现那是红细胞污染——红细胞没细胞核，但残留的 RNA 碎片会影响计数。这个图能提前预警。

4.6 知识体系总览

为了让你对整个流程有整体感，我画了一张框架图，从原始数据到初步探索一目了然：

这张图把今天讲的步骤串起来了，后面几章我们会基于这个对象继续往下走。

4.7 避坑指南（我的经验）

检查基因名重复： 有些数据集的 features.tsv 里基因名可能有重复（比如同义名），Seurat 会报错。我建议先用 table(duplicated(rownames(counts))) 检查，有重复就手动去重或用 make.unique。
内存问题： 如果你的细胞数超过 10 万，创建对象时别设 min.cells 太小，否则对象会非常大。我一般先 Read10X 后再用 CreateSeuratObject，并调高 min.cells 到 5-10 来节省内存。
线粒体基因的前缀： 小鼠是 ^mt-，斑马鱼是 ^mt-，但有些物种不是标准命名，得自己查。曾经有个客户用非模式生物，我建议先 grep 出线粒体基因名再手动传列表。
不要迷信默认参数： min.features=200 对 10X 数据还行，但如果你的数据是 Smart-seq2（几百个细胞、每个细胞几千基因），这个值可以设为 500 或更高。根据实验来调。

好，到这里你应该能自己创建 Seurat 对象，并看懂初步的质量指标了。这一章内容扎实，把基础打牢，后面做标准化和降维时就不会手忙脚乱。