📚 课程目录第3章单细胞数据预处理

单细胞数据预处理：从原始计数到可信细胞群体

预处理这一步，说白了就是给原始数据「洗澡换衣服」。我见过不少项目，数据刚拿到手就急着跑CellChat，结果出来的通讯网络全是噪声。嗯，这一步省不得，省了后面全是坑。

我个人习惯把预处理拆成三个核心动作：细胞质控（QC）、doublet检测、过滤低质量细胞。下面一个一个说。

细胞质控（QC）—— 源头把关

QC的核心是找出那些「要死不活」的细胞。你想想看，一个细胞如果线粒体基因占比飙到20%以上，多半是膜破了，内容物泄露。这种细胞在通讯分析里会虚假地高表达某些配体受体，把结果带歪。

我一般用三个指标做初步筛选：

nCount_RNA：每个细胞的UMI总数。太低说明细胞空载，太高可能是doublet。
nFeature_RNA：检测到的基因数。太低可能是死细胞，太高也是doublet嫌疑。
percent.mt：线粒体基因占比。通常 >10-15% 就要警惕。

这里贴一段常用的Seurat QC代码，我项目里几乎每回都用：

# 计算线粒体基因比例
sce[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(sce, pattern = "^MT-")

# 查看分布
VlnPlot(sce, features = c("nCount_RNA", "nFeature_RNA", "percent.mt"))

# 常用过滤阈值（可调整）
sce <- subset(sce, 
              nCount_RNA > 500 & nCount_RNA < 8000 &
              nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 3000 &
              percent.mt < 15)

我的小建议：阈值不要死搬硬套。不同组织、不同建库方案，分布差很多。先做小提琴图看看数据分布，再定阈值。我曾经在一个脑组织数据里，正常神经元的中位UMI只有800，硬套通用阈值直接干掉了一大半细胞。

常用QC指标参考阈值
指标	典型下限	典型上限	备注
nCount_RNA	500	8000	根据文库深度调整
nFeature_RNA	200	3000	低基因数可能是空液滴
percent.mt	—	15%	组织差异大，肌肉组织可放宽到20%

doublet检测 —— 揪出「双胞胎」

doublet就是两个细胞被同一个barcode捕获了。在10X数据里，doublet率大概1%每1000个细胞，如果你捕获了8000个细胞，预计有8%左右的doublet。CellChat对细胞身份敏感，doublet会硬塞出假通讯。

我现在主要用两种方法：

DoubletFinder：基于人工再混入模拟doublet做分类，准确率不错，就是慢。
scDblFinder：集成在SingleR包链里，快，对大规模数据友好。

坑，一定要填：doublet检测必须在QC过滤之后才能做。为啥？因为死细胞的异常特征会干扰分类器，模型会把死细胞也判成doublet。我曾有一次先用原始数据跑DoubletFinder，结果1/3的细胞被标为doublet……后来发现是大量空液滴的干扰。

下面是用scDblFinder的示例：

library(scDblFinder)
sce <- scDblFinder(sce, samples = "sample_id")

# 查看doublet比例
table(sce$scDblFinder.class)

# 过滤掉 doublet
sce <- sce[, sce$scDblFinder.class == "singlet"]

过滤低质量细胞 —— 清除干扰

QC和doublet检测做完了，还不能急着收工。我习惯再加一道「手动过滤」：把那些明明存活率正常、但基因表达谱极其稀疏的细胞也去掉（比如nFeature_RNA极低但UMI却很高的异常样本）。说白了，就是做一次最后的质检。

另外，如果你的数据来自多个批次，强烈建议在合并之前先单独对每个样本做QC和doublet检测。否则批次效应会骗过doublet检测器，把批次差异当doublet。

# 按样本循环处理
for (s in unique(sce$sample_id)) {
  sub <- sce[, sce$sample_id == s]
  sub <- scDblFinder(sub)
  sub$scDblFinder.class[is.na(sub$scDblFinder.class)] <- "singlet"
  sce$scDblFinder.class[sce$sample_id == s] <- sub$scDblFinder.class
}

# 最后一步：过滤掉 QC flag 和 doublet
sce <- sce[, sce$scDblFinder.class == "singlet" &
            sce$nFeature_RNA > 200 &
            sce$nCount_RNA > 500 &
            sce$percent.mt < 15]

核心原则：CellChat的输入是干净的高质量细胞矩阵。宁可严格一点流失少量细胞，也要把假通讯扼杀在摇篮里。

整个预处理流程可以用下面这张图串起来：

预处理做扎实了，后面CellChat的批次效应校正才能更有底气。别嫌麻烦——这一步花的时间，将来都会在通讯网络的准确性上补回来。