📚 课程目录第4章数据预处理（Visium）

4. 数据预处理（Visium）：质控指标、过滤低质量斑点、标准化、高变基因选择

拿到 Visium 原始数据后，第一件事不是跑分析，而是做质控。这一点我吃过亏——第一次做整合时，上来就标准化，结果低质量斑点的噪声把整合效果全带偏了。

说白了，预处理就是把“脏数据”洗成可用的样子。对于 Visium 来说，我们需要关注四个步骤：质控指标评估、过滤低质量斑点、标准化、高变基因选择。

4.1 质控指标，看什么？

我个人习惯先扫一眼三个核心指标：

n_counts：每个斑点的 UMI 总数。代表测序深度和捕获效率。
n_genes：检测到的基因数。代表斑点本身的细胞复杂度。
percent.mt：线粒体基因占比。代表细胞损伤或死亡的比例。

为什么会重点关注这三个？我在项目中遇到过一件事：有些样本质控看起来不错，但一查 percent.mt 已经飙到 30% 以上——结果整合后 batch effect 特别严重。其实早该在第一步就把它过滤掉。

我的习惯：先运行 scater 或者 Seurat 的 plotQCMetrics 看一眼分布，再决定阈值。别一上来就设死数字。

4.2 过滤低质量斑点

阈值怎么设？没有标准答案。但我能给你一套实用的参考：

指标	经验阈值范围	说明
n_counts	> 500 且 < 15,000	过低说明斑点可能空；过高可能是双细胞或组织碎片
n_genes	> 250	低于此值，基因多样性不够，后续分析噪声大
percent.mt	< 20%	超过 20%，细胞状态堪忧

但注意，这些不是铁律。你想想看，不同组织类型差异很大——脑组织的 n_counts 通常比肿瘤组织低很多。我曾经做一个小鼠脑样本，过滤阈值放到才 200 个基因，结果发现有些有生物学意义的稀疏区域被砍掉了。后来我改用双倍 MAD（中位数绝对偏差）方法来自动判定阈值。

代码示例：用 Seurat 做基础过滤

library(Seurat)
library(ggplot2)

# 读取 Visium 数据
visium_data <- Load10X_Spatial(
  data.dir = "path/to/spaceranger/outs",
  filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5"
)

# 计算质控指标
visium_data[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(
  visium_data, pattern = "^MT-"
)

# 直观检查分布
VlnPlot(visium_data,
  features = c("nCount_Spatial", "nFeature_Spatial", "percent.mt"),
  ncol = 3, pt.size = 0.1)

# 过滤低质量斑点
visium_data <- subset(visium_data,
  subset = nCount_Spatial > 500 &
           nCount_Spatial < 15000 &
           nFeature_Spatial > 250 &
           percent.mt < 20)

我曾经踩过一个坑：用 Seurat 的 subset 过滤后忘记检查剩余斑点数。有一次过滤得太狠，本来 4000 个斑点只剩 800 个，后续统计分析都没显著性。所以过滤后一定要跑 dim(visium_data) 看看总数，做到心里有数。

4.3 标准化

标准化这一步，说白了就是消除测序深度带来的差异。Visium 不同切片间的测序深度可能差好几倍，直接比较会误导下游分析。

我个人最推荐两种方式：

LogNormalize：Seurat 默认方法。对每个斑点，将 UMI 数除以总 UMI 再乘以 scale.factor，最后 log1p 转换。
SCTransform：基于正则化负二项回归，效果更好，但计算量大一些。

代码示例：LogNormalize 标准化

# 标准化（Seurat 默认）
visium_data <- NormalizeData(visium_data,
  normalization.method = "LogNormalize",
  scale.factor = 10000)

# 或者用 SCTransform（需要提前安装 sctransform）
visium_data <- SCTransform(visium_data,
  vars.to.regress = "percent.mt",
  verbose = TRUE)

这里有个知识点：SCTransform 内部直接包含了高变基因选择，所以当你用 SCTransform 后，可以跳过 4.4 节的手动高变基因筛选。但如果你用 LogNormalize，就得自己选一次。

我的建议：如果是单样本探索，用 LogNormalize 够了。如果要做跨样本整合，我强烈推荐 SCTransform——它减少了好多人工调参的麻烦。

4.4 高变基因选择

高变基因（HVG）就是那些在不同斑点间表达差异最大的基因。选择它们能降低维度、聚焦信号。你想想看，如果 20,000 个基因全跑进去，PCA 都会被 housekeeping 基因淹没。

Seurat 提供了两种方法：

vst：基于方差稳定变换，速度最快。适合大数据集。
mean.var.plot：基于均值-方差关系，传统方法，效果也不错。

选多少高变基因？我一般选 2000 个。太少会丢失信息，太多会引入噪声。我记得有一次选 5000 个，结果 PCA 的前 10 个 PC 解释方差反而下降了——说明过多基因稀释了信号。

代码示例：高变基因选择

# 识别高变基因（用 vst 方法）
visium_data <- FindVariableFeatures(visium_data,
  selection.method = "vst",
  nfeatures = 2000)

# 查看选中的基因
top10 <- head(VariableFeatures(visium_data), 10)
print(top10)

# 将数据缩放到标准范围（准备后续 PCA）
visium_data <- ScaleData(visium_data,
  features = rownames(visium_data))

注意：SCTransform 已经内置了高变基因选择，如果用 SCTransform 标准化了，就不要重复调用 FindVariableFeatures，否则会覆盖掉 SCTransform 的结果。

到了这一步，你的 Visium 数据就备好了。接下来可以进入 PCA 降维、聚类分析，或者直接和 Slide-seq 做整合。但我要强调一句：预处理的质量直接决定后续整合的成败。我见过太多项目因为质控太松或者标准化方法选错，整合后 batch effect 满天飞，怎么调都调不回来。

把这一步走扎实，后面就顺了。