第2章：单细胞测序基本原理——10x Genomics与Drop-seq的工作流程
咱们开始讲真正干活的东西。单细胞测序的流程，说白了就是把一个个细胞分到独立的“小隔间”里，给每个细胞贴上独一无二的条形码。这样测出来的数据，我们才知道哪段序列来自哪个细胞。
我个人接触最多的就是10x Genomics和Drop-seq这两个平台。很多同学觉得它们高大上，但拆开看，核心逻辑就那几步：“分细胞 → 贴条形码 → 逆转录 → 扩增 → 测序”。今天咱们就把这层窗户纸捅破。
2.1 10x Genomics：微流控“双液滴”系统
我刚开始做单细胞项目时，上手就是10x的Chromium平台。它的核心部件是那个微流控芯片，像个小迷宫。你可以这么理解：它同时引入三路液体——细胞 + 试剂、凝胶微珠（GEM）、油。
这三路液体在芯片的交叉口汇合，形成一个个油包水的小液滴。每个液滴里，理想情况就一个细胞，再加一个带有独特条形码的凝胶微珠。为什么强调“理想情况”？因为你想想看，总会有两个细胞挤进同一个液滴，或者某个液滴空空的。这就是后面我们要做质控的原因。
2.2 10x的完整湿实验步骤
我习惯把10x的工作流分成四个阶段，方便记忆：
- 样本制备与分区：把组织消化成单细胞悬液，调整浓度，跟试剂混合后通入微流控芯片。
- GEM生成与细胞裂解：在油包水液滴里，细胞膜被裂解，释放mRNA。这些mRNA与凝胶微珠上的poly-T序列结合。
- 逆转录与条形码标记：在液滴内完成逆转录。cDNA上会带上细胞barcode和UMI。
- 破乳扩增与文库构建：打破油滴，回收cDNA，进行PCR扩增。然后加上测序接头，构建成可上机的文库。
| 步骤 | 关键产物 | 对质控的影响 |
|---|---|---|
| GEM生成 | 油包水液滴 | 细胞捕获效率、双胞率 |
| 逆转录 | 带Barcode+UMI的cDNA | UMI多样性、基因覆盖度 |
| PCR扩增 | 扩增后的cDNA文库 | PCR重复率、文库复杂度 |
2.3 Drop-seq：纳米孔板方案
再来看看Drop-seq。它是哈佛团队开发的早期方案，也是10x的前身思路。两者的核心区别在于：10x用凝胶微珠，Drop-seq用聚合物微珠，并且分区方式不一样。
我做项目时，用Drop-seq处理过一些低成本的小样本。它的流程是这样的：
- 微珠制备：先合成一批带条形码的聚合物微珠。每个微珠大概有1亿个寡核苷酸链。
- 液滴生成：用微流控设备让细胞悬液和微珠悬液在油中汇合，形成液滴。这一步不像10x那么“自动化”，手动控制多一点。
- 细胞裂解与逆转录：在液滴里完成细胞裂解，mRNA结合到微珠上，进行逆转录。
- 破乳回收：打破液滴，回收带cDNA的微珠。
- PCR扩增与测序：对微珠表面的cDNA扩增后上机。
嗯，这里要注意：Drop-seq的细胞捕获效率通常比10x低，一般在5%~15%左右。10x能做到50%~65%。为什么会这样？因为Drop-seq的微珠和细胞是随机碰撞进液滴的，概率上本身就低很多。
2.4 两大平台的核心对比
简单总结一下，我经常在课程里这样对比：
| 特性 | 10x Genomics | Drop-seq |
|---|---|---|
| 分区方式 | 微流控芯片 + GEM | 微流控 + 油包水液滴 |
| Barcode载体 | 凝胶微珠（GEM） | 聚合物微珠 |
| 细胞捕获效率 | 50%-65% | 5%-15% |
| 通量 | 每次可测500-50000个细胞 | 每次数百到数千个 |
| 成本（单细胞） | 较高 | 较低 |
| 主流程度 | 行业标准 | 科研为主 |
但不管你用哪个平台，核心逻辑是一样的：每个细胞得到一组独特的barcode和UMI。barcode告诉你这是哪个细胞，UMI告诉你同一个基因被捕获了几次。
2.5 流程核心逻辑图
我把两套流程抽象成一张图，你看一遍就能理解为什么后续要卡基因数和UMI阈值了。
你看，不管10x还是Drop-seq，最终产出的都是带有细胞身份标签（Barcode）和分子身份标签（UMI）的序列。这些数据到了我们的生物信息学分析流程里，就是那些基因表达矩阵的原始素材。而基因数和UMI数的分布，就是判断每个“细胞”质量好坏的第一道关卡。