核心质控指标概览：常用指标介绍
做单细胞分析的第一步，就是看懂那些常见的质控指标。我刚入行时面对那一堆nFeature、nCount、percent.mt真是头大，后来踩了不少坑才摸清楚门道。这一节我们挨个捋一遍，我把每个指标的本质、经验阈值和常见陷阱都聊透。
先看一张整体关系图，方便你脑子里先搭个框架。
整体逻辑：先看基因数和UMI把明显异常的细胞筛掉，再看线粒体比例揪出死亡细胞，最后根据组织类型决定是否处理核糖体和红细胞污染。不是所有指标都要一套固定阈值，要结合样本背景灵活调整。
基因数（nFeature_RNA）
说白了，就是每个细胞里检测到了多少种不同的基因。我习惯先看这个指标的分布，因为它直接反映细胞的复杂度和质量。
- 正常范围：200～5000（10x数据，人/鼠）。低于200的基本是空液滴或死细胞，高于5000的可能是双细胞。
- 为什么重要：基因数太低，后续的聚类和差异表达就没法做；太高又可能是污染。
- 我踩过的坑：有一次一个样本的nFeature_RNA普遍只有100～300，我以为是组织太难处理，后来发现是建库时漏加了反转录酶……
# Seurat 中的可视化
VlnPlot(sce, features = "nFeature_RNA")
经验阈值：下限我一般设 200，但如果测的是纯化后的稀少细胞（如中性粒细胞），可以降到 100。上限通常设 5000，但对于容易聚集的细胞（如肿瘤细胞系），我可能会放宽到 6000。
UMI总数（nCount_RNA）
基因数管“品种”，UMI总数管“数量”。每个基因可能有多条转录本，UMI就统计了总的分子数。
- 和基因数的关系：两者通常呈正相关，但如果某细胞nCount很高而nFeature很低，很可能是单个基因大量扩增（比如免疫细胞中某条链的过度表达）。
- 异常情况：nCount特别高但nFeature也高 → 双细胞；nCount低但nFeature正常 → 测序深度不足。
个人习惯：我会同时画散点图，把nCount_RNA和nFeature_RNA放到一个图里，那些偏离对角线的点就是重点关注对象。
# 双指标散点图
FeatureScatter(sce, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")线粒体基因比例（percent.mt）
这是质控里最关键的指标之一。计算方法是线粒体基因的UMI总和除以总UMI。比例过高意味着细胞膜破损，细胞质里的RNA漏出去了，只剩下核外的线粒体基因。
- 常用阈值：10%～20%。我一般用15%作为默认值。
- 避坑指南：我曾经处理过一个脂肪组织样本，所有细胞percent.mt都高达40%以上。起初以为是组织解离太暴力，后来发现是脂肪细胞代谢旺盛，线粒体本身比例就高。所以不能一刀切——先看看有没有一个明显的双峰分布，有的话就在谷底切。
# 计算线粒体比例（R语言）
sce[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(sce, pattern = "^MT-")
# 查看分布
hist(sce$percent.mt, breaks=50, main="线粒体比例分布")
abline(v=15, col="red", lwd=2)
注意：不同物种的线粒体基因前缀不同。人用
^MT-，小鼠用^mt-（注意大小写），斑马鱼用^mt-或^MT-。做混样数据时务必核对。
核糖体基因比例
这个指标用的人相对少一点，但有时很管用。核糖体基因（如RPL/RPS）在活跃分裂的细胞中表达高，但死细胞里也会因为核糖体RNA稳定而偏高。
- 应用场景：如果percent.mt正常但核糖体比例异常高（比如>50%），可能说明细胞处于应激状态或者样本处理过程有RNA降解。
- 我的做法：一般不会用来过滤，而是作为一个辅助参考。如果你看到核糖体比例>60%且同时nFeature很低，那这个细胞大概率快不行了。
# 计算核糖体比例
sce[["percent.rb"]] <- PercentageFeatureSet(sce, pattern = "^RP[SL]") # 人/小鼠通用红细胞污染
这个指标主要针对血液或骨髓样本。红细胞本身没有核，但它们的RNA（特别是血红蛋白基因，如HBA1、HBB）会在单细胞数据中出现，因为红细胞在裂解过程中会释放RNA。
- 怎么算：取血红蛋白基因（HBA1、HBA2、HBB、HBD等）的UMI总和除以总UMI。
- 阈值：我通常看绝对值，如果某个细胞中血红蛋白基因占了总UMI的5%以上，我就标记为红细胞污染，准备剔除。
- 避坑指南：我曾经在骨髓样本中发现一群细胞全部表达高水平的HBB，一开始以为是红细胞前体，后来发现是实验过程中红细胞没裂解干净。用这个指标一下就抓出来了。
# 计算红细胞污染比例
hb_genes <- grep("^HB[^(P)]", rownames(sce), value = TRUE) # 排除HBP
sce[["percent.hb"]] <- PercentageFeatureSet(sce, features = hb_genes)| 指标 | 典型阈值 | 常见问题 | 建议动作 |
|---|---|---|---|
| nFeature_RNA | 200～5000 | 过低 → 空液滴/死细胞；过高 → 双细胞 | 视分布调整下限，上限可放至6000 |
| nCount_RNA | 通常与nFeature联动 | 偏离对角线 → 异常表达或双细胞 | 配合散点图检查 |
| percent.mt | 10%～20% | 过高 → 细胞死亡/膜破损 | 找双峰谷底切，勿死套固定值 |
| 核糖体比例 | 一般不设硬阈值 | 异常高 → 应激/降解 | 辅助判断，不强制过滤 |
| 红细胞污染 | 血红蛋白基因占比>5% | 骨髓/血液样本常见 | 直接过滤，避免影响聚类 |
一句话总结：基因数和UMI看“有没有货”，线粒体比例看“活不活”，红细胞看“干不干净”，核糖体当参考。我每次跑完质控都会把这几个指标画在一个仪表板里，几分钟就能定位问题。
嗯，这些指标就是质控的“基本功”。你可以先用它们走一遍过滤流程，等积累了经验再去研究更高级的质控方法——比如用细胞周期基因、用机器学习做异常检测。但相信我，把上面这五个指标吃透了，90%的常见问题都逃不过你的眼。