📚 课程目录第1章单细胞测序简介

第一课：单细胞测序简介——从细胞悬液到表达矩阵

各位好，我是老张。在单细胞数据分析这行摸爬滚打了快十年，今天咱们聊聊质控指标的设计。

很多人觉得质控就是设几个阈值，把不合格的细胞过滤掉就完事了。其实不然。我见过太多人因为不了解数据是怎么来的，导致阈值设得毫无道理。你想想看，连数据产生过程都不清楚，怎么定质控标准？

所以这第一课，咱们先把基础打牢。重点讲透三件事：scRNA-seq的技术原理、实验流程的完整链路、从细胞悬液到表达矩阵的数据流。说白了，就是搞清楚你手里那份表达矩阵，到底是怎么折腾出来的。

1.1 为什么需要做单细胞测序

我最早是做传统RNA-seq的，那时候一次实验下来拿到的是成千上万细胞的平均表达量，就是所谓的“bulk”信号。结果嘛，平均完，稀有的细胞亚群直接消失在了噪声里。

举个例子，肿瘤微环境里的某些免疫细胞，可能只占整个样品的1%。用bulk RNA-seq测，根本看不到它们的影子。而单细胞测序可以一个细胞一个细胞地看，这事就好办了。

所以，单细胞测序的核心能力就两个：分辨率和异质性解析。

维度	Bulk RNA-seq	scRNA-seq
检测对象	组织/细胞群体	单个细胞
表达值	总体平均值	单个细胞表达谱
数据维度	1个样本1个值	1个样本N个细胞 × M个基因
适用场景	差异表达、通路分析	细胞分群、稀有细胞鉴定、发育轨迹

1.2 scRNA-seq的技术原理

主流平台怎么区分细胞？靠的是 barcode 。每个细胞捕获时，会被分配一段独特的DNA序列作为标签，就像给每个人发一个身份证号。之后所有来自这个细胞的转录本，都带这个标签。

但还有一个更关键的概念——UMI (Unique Molecular Identifier)。UMI是一段随机序列，用来标记每一条mRNA分子。为什么需要这玩意？因为PCR扩增会引入偏差，同一条mRNA分子扩增后会产生大量拷贝，但通过UMI我们可以准确知道：原来它们都来自同一条分子。

核心要点：Barcode标记细胞，UMI标记分子。两者结合，才能从测序数据精确还原每个细胞的基因表达量。

1.3 典型实验流程

我习惯把整个实验流程分四个大阶段来讲，这样好记。

阶段一：单细胞悬液制备

这一步最容易被忽视，但实际出问题最多的就是它。我曾经碰到过一个项目，做了三次都拿不到合格的数据，后来发现是组织解离过度，细胞都碎了，基质里全是游离的RNA。

组织剪碎 + 酶消化（胶原酶、胰蛋白酶等）
过滤去除细胞团块和碎片
细胞计数和活性检测（一般要求活性 > 80%）

阶段二：细胞捕获与建库

以最流行的10x Genomics平台为例，用的是油包水液滴技术。细胞悬液和带有barcode、UMI的凝胶微珠被包裹进液滴里，在液滴内完成细胞裂解、mRNA捕获和逆转录。

微流控芯片生成GEMs（凝胶微珠乳浊液）
液滴内mRNA与微珠上的捕获序列结合
逆转录生成cDNA，带上barcode和UMI
打破油滴，收集cDNA进行PCR扩增
酶切打断，加上Illumina测序接头

阶段三：高通量测序

建好的文库上机测序。一般双端测序：Read 1 读barcode和UMI，Read 2 读cDNA片段序列。


10x 测序读段结构示例：
Read 1: 26bp（10x Barcode + UMI）+ 1bp 间隔
Read 2: 98bp（cDNA insert）
Index: 8bp（样本标签）

阶段四：数据预处理

测序仪出来的原始数据是BCL格式，需要转换成FASTQ。然后跑标准的处理流程进行比对、定量、生成表达矩阵。

我的建议：如果你用10x数据，建议直接上Cell Ranger。它把所有步骤打包好了，你只需要提供FASTQ文件和参考基因组。新手先用官方pipeline跑通数据再说。

1.4 数据产生过程：从FASTQ到表达矩阵

这是整节课的硬核部分。我看过不少人的分析代码，发现他们直接跳过这一步，上来就用原始矩阵做质控。嗯，这里要注意，很多管线里的默认参数不一定适合你的数据。

标准的流程分为四步：

barcode处理：从Read 1中提取barcode序列，校正barcode（允许1~2个碱基错配），分配每个读段到对应细胞。
UMI处理：从Read 1中提取UMI序列，记录每个转录本的分子身份。
比对：Read 2与参考转录组比对，确定基因来源。
定量：对每个细胞中的每个基因，统计检测到几个不同的UMI，生成计数矩阵。

如果你用10x的 Cell Ranger，一条命令就能跑完：


cellranger count --id=Sample1 \
                --transcriptome=/path/to/ref/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
                --fastqs=/path/to/fastqs \
                --sample=Sample1 \
                --localcores=8 \
                --localmem=64

跑完后，找到 outs/filtered_feature_bc_matrix 目录，里面有三个文件：

matrix.mtx：表达矩阵（坐标格式）
barcodes.tsv：细胞barcode列表（每一行一个细胞ID）
features.tsv：基因注释（每一行一个基因ID和名字）

避坑提示：Cell Ranger默认有两个矩阵：raw_feature_bc_matrix 和 filtered_feature_bc_matrix。前者包含所有捕获到的barcode，后者仅保留它认为是细胞的那些。我建议你质控时尽量用raw矩阵从头处理，不要把别人的过滤标准当作真理。我曾经在两次分析中用了filtered矩阵，结果有些真实细胞被误杀了。

1.5 最终产品：表达矩阵长什么样

说白了，你最后拿到的东西就是一张表格。行是基因（大约20,000~30,000个），列是细胞（几千到几万个不等），每个格子表示某个基因在某个细胞中检测到的UMI数量。

举个例子，一个简单的小矩阵：


        Cell_001  Cell_002  Cell_003
GAPDH       142        89       203
ACTB        231       156       312
MALAT1     1089       825      1432
TP53          0         2         0
CD3E          0        45         1

注意看，大部分基因为0。一个典型的单细胞样本里，90%以上的格子都是0。这就是所谓的dropout事件，技术原因也好，生物学原因也好，拿到数据后你会面对一个极其稀疏的矩阵。

关键认识：单细胞表达矩阵的稀疏性、零膨胀特性，决定了后续质控指标的设计不能简单套用bulk RNA-seq的方法。这就是为什么我们要专门讲基因数和UMI阈值的设定。

好了，第一课到这里。你理解了数据是怎么产生的，下一课我们就能开始动手看看怎么评估每个细胞的质量了。记住一句话：质控不是随便设一个阈值，而是理解数据生成过程后，做出的合理选择。