第1章 单细胞测序技术概览：主流平台与质控切入点
做单细胞数据分析这些年，我最大的感触是：不了解数据是怎么来的，就别谈质控优化。平台不同，数据的“脾气”完全不同，质控参数那套玩法也得跟着变。
今天咱们就聊聊主流单细胞测序平台——10x Genomics、Smart-seq2、Drop-seq。你想想看，都是从单个细胞里捞RNA，但这几个平台的路数、坑点、质控重点，差得可不是一星半点。
平台技术路线一览
先上一张我手绘的平台对比表，后面挨个拆解。
| 对比维度 | 10x Genomics | Smart-seq2 | Drop-seq |
|---|---|---|---|
| 细胞通量 | 数千-数万 | 96-384孔板 | 数千-数万 |
| RNA全长覆盖 | 3'端偏向 | 全长覆盖 | 3'端偏向 |
| UMI使用 | 有（分子条形码） | 无 | 有（分子条形码） |
| 细胞条形码 | GEM bead 自带 | 孔板位置编码 | Bead 携带 |
| 单细胞隔离方式 | 微流控油包水液滴 | 孔板物理隔离 | 微流控油包水液滴 |
| 试剂成本/细胞 | 中-高 | 高 | 低 |
| 建库周期 | 1-2天 | 2-3天 | 1-2天 |
这张表说白了就是告诉你：通量高、成本低的平台，往往信息量会打折扣；信息量大的平台，通量和成本又吃紧。质控就是在这些限制条件里找平衡。
10x Genomics：工业级高通量的「代表作」
10x 的 Chromium 控制器，今天基本上快成单细胞领域的标配了。我自己做项目时最早接触的就是这个平台，当时还挺震撼的——一个 Gel Bead 上带着一条 oligo，这条 oligo 上绑着 cell barcode、UMI 和 poly-dT，每个 Bead 就相当于一个细胞的“身份证加计数器”。
工作原理你大概了解：细胞和 Bead 一起进液滴，裂解后 mRNA 被 Bead 上的 poly-dT 钓住，洗掉背景，再进行逆转录和 cDNA 扩增。但这里有个关键点——10x 只捕获 mRNA 的 3' 端，所以你不能拿它做剪接异构体的精细分析。
质控核心关注点：
- 细胞通量高，但存在「空液滴」和「双细胞/多细胞」污染
- UMI 有效降低 PCR 偏好，但 UMI 纠错算法本身会引入偏差
- 3' 端偏向导致基因体覆盖不均，gene body coverage 是重要质控指标
- GEM bead 捕获效率波动大，library complexity 是硬指标
我个人习惯在质控阶段，先看 Cell Ranger 输出的 metrics_summary.csv。这里有个我踩过的坑——有一次项目里，这个指标超出预期一倍，我以为是数据质量超高，后来一查，发现是大量红细胞血红蛋白 mRNA 贡献的，说白了就是红细胞污染。
Smart-seq2：单细胞精度的「全基因组测序」
Smart-seq2 走的是另一条路：全长的，能测到转录本 5' 和 3' 的全部信息。适合做可变剪接、RNA 编辑、等位基因特异性表达这些精细活。
但是，这东西造细胞通量极低，一批实验最多做几百个细胞。我前段时间帮一个合作团队做质控方案，他们用 Smart-seq2 测了肿瘤浸润 T 细胞的免疫组库——这活儿 10x 做不了，因为 10x 只测 3' 端，没法匹配全长 V(D)J 序列。
这个平台没有 UMI，也不靠 barcode 区分细胞，直接按孔板物理位置来。所以，它的质控难点跟 10x 完全不同。
实践建议：
- 孔板实验时，必须用 real-time PCR 或者高灵敏荧光定量法确认每个孔的 cDNA 产量
- 因为无 UMI 标记，PCR duplications rate 会严重影响定量准确性，必须严格评估
- 转录本全长覆盖率是核心质控指标——5' 端 drop-off 意味着逆转录效率低
Drop-seq：学术界出品的「性价比之选」
Drop-seq 是 McCarroll 实验室开发的，从原理上跟 10x 很像——油包水液滴 + Bead 上的 barcode 和 UMI。但它的 Bead 是手工合成分装，不是工业级生产，每个 Bead 的 barcode 序列是随机组合的，所以存在 barcode 冲突约 1% 以内的风险。
我做课题时用过 Drop-seq 做海鞘胚胎的转录组图谱，前期质检差点崩溃——Bead 的捕获效率方差特别大，同一批实验，有的液滴只捕获了几百条 mRNA，有的却捕获了几千条。质控标准得单独定。
避坑指南
我曾经在一个 Drop-seq 项目里，把所有细胞的 UMI 计数直接 filter 在 500 以上的阈值。结果后来发现，那些低 UMI 的细胞其实是某类小细胞（尺寸小，mRNA 含量低），被我全扔了，导致那类细胞在后续分析里完全缺失。嗯，从此以后我养成了先看细胞大小分布再定质控阈值的习惯。
平台数据特征对质控参数的影响
你现在应该能理解了——平台不同，决定了我们该重点关注哪些质控指标。我整理了一个简单对照表。
| 质控参数 | 10x Genomics | Smart-seq2 | Drop-seq |
|---|---|---|---|
| 线粒体比例阈值 | 10%-25% | 5%-15% | 10%-30% |
| 核糖体比例阈值 | 1%-5% | 0.5%-3% | 1%-8% |
| 基因检测数下限 | 200-500 | 500-2000 | 150-400 |
| UMI计数下限 | 500-1000 | 无 | 300-800 |
| 双细胞去除方式 | DoubletFinder/DoubletDetection | 人工检查 | DoubletFinder/DoubletDetection |
| PCR duplicate 处理 | UMI 去重 | 不可用（建议避免扩增超过 18 cycle） | UMI 去重 |
看到没有？同样的质控指标，不同平台的阈值差异非常大。千万不要拿着 10x 的质控经验套到 Drop-seq 上——我最早这么干过，结果把所有可用细胞都过滤掉了，白做了两轮实验。
这个图的逻辑是这样的：不同的实验平台决定了数据的基本特征（比如全长 vs 3'端、有 UMI 还是无 UMI），这些数据特征又直接决定了我们在做质控时该关注哪些指标、该设哪些阈值。质控不是死的，要从数据产生的源头去理解。