4. 质控数据格式：FASTA、FASTQ、GFF3、GTF、BED、VCF 等格式介绍

做基因组注释质控，第一件事就是搞清楚你在跟什么格式打交道。我这些年批过不少批次数据，发现一大半问题都出在格式理解上——不是字段弄反了，就是坐标搞乱了。说白了，这些格式就像不同工种用的工具：你不能拿扳手去拧螺丝刀。下面我把最常用的六种格式捋一遍，结合我踩过的坑，给你讲清楚。

4.1 FASTA —— 序列的基础盘

FASTA 是最简单的序列格式。一行头（以 > 开头），后面跟着碱基或氨基酸序列。没有质量值，没有额外属性。

>chr1
ACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGT
>chr2
TGCATGCATGCATGCATGCATGCATGCA

我个人习惯：拿到 FASTA 第一件事先跑 seqkit stat，看看每条染色体的长度、N 含量。为什么？因为很多组装出来的 FASTA 有大量未解开的 N，会影响比对和注释。

还有一个坑：FASTA 里换行长度不统一。有些工具要求每行 80 个碱基，有些接受任意长度。我遇到过把 60bp 一行的 FASTA 喂给 bwa mem，它其实能处理，但换行不一致时 samtools faidx 会报错。所以建索引前最好做一遍 seqkit seq -w 80 重新格式化。

4.2 FASTQ —— 质量就在名字里

FASTQ 和 FASTA 长得像，但多了质量行。每一组有四行：@头、序列、+头（可省略）、质量值。

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393
GTATCATCATAAGTACCTGCGACATACTCATTCTAA
+
IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

质量值那一行最容易被忽略。我曾经处理一批 RNA-seq 数据，FASTQ 看起来正常，结果比对率只有 30%。拿 fastqc 一测，发现质量值编码是 Sanger，而比对器却按 Illumina 1.3 去解释，结果质量全部偏高。嗯，这里要注意：质量编码方式必须在头信息或元数据里注明。常用的有三种：

4.3 GFF3 —— 注释的“本体”格式

GFF3 是目前最通用的基因注释格式。每行 9 列，以 tab 分隔。第 9 列是属性，可以嵌套多个键值对。

chr1    .       exon    1000    1200    .       +       .       ID=exon1;Parent=transcript1
chr1    .       CDS     1100    1200    .       +       0       ID=cds1;Parent=transcript1

我个人觉得 GFF3 比 GTF 更灵活。属性里可以放 ID、Parent、Name、Note 等，而且支持双向关联。但这也带来一个麻烦：属性之间的引用关系必须严格一致。如果某个 exon 的 Parent 指向一个不存在的 transcript，整个注释文件就废了。

另一个常见错误：坐标系统。GFF3 是 1-based，而且区间是闭区间。例如起始 1000，结束 1200，包含第 1000 和第 1200 两个碱基。而 BED 是 0-based 半开区间。两者转换时经常差 1，我在这上面吃过亏。

4.4 GTF —— 比 GFF3 更“严”

GTF（也叫 GFF2）格式，和 GFF3 很像，但第 9 列的属性必须用 gene_id 和 transcript_id 开头。其他属性和 GFF3 不一样，不能用 Parent，而是用 transcript_id 来关联 exon 和 CDS。

chr1    .       exon    1000    1200    .       +       .       gene_id "gene1"; transcript_id "t1";
chr1    .       CDS     1100    1200    .       +       0       gene_id "gene1"; transcript_id "t1";

我建议：如果上游工具明确要求 GTF，那就用 GTF；否则优先用 GFF3。为什么？因为 GTF 的参数更少，很多物种特有属性（如 UTR 类型、生物类型）很难塞进去。而且某些比对器（如 STAR）原生支持 GTF，但如果你给它一个 GFF3，它会认错 exon_number 之类的字段。

4.5 BED —— 轻量化区间工具

BED 文件最少只需要 3 列：染色体、起始、结束。起始是 0-based，结束是 1-based（半开区间）。经常用于 ChIP-seq peaks、覆盖度统计等。

chr1    1000    2000    peak1    42    +
chr1    3000    3500    peak2    18    -

我最常用的是 BED 的第六列（链方向）、第七列（thickStart）、第八列（thickEnd）、第九列（itemRGB）。不过说实话，质控时最要紧的是检查 起始 < 结束 和 坐标在染色体长度范围内。我之前用 bedtools intersect 时，遇到过一个 BED 文件第 1 行 0-10，但染色体长度才 5，结果跑出来一堆负数长度，导致程序崩溃。

4.6 VCF —— 变异的详细档案

VCF 是存储单核苷酸变异、插入缺失、结构变异的通用格式。头部分行以 ## 开头，数据行 8 列 + 样本列。第 8 列 INFO 字段有很多预定义标志（如 DP、AF、QS）。

##fileformat=VCFv4.2
#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO
chr1    1000    .       A       G       30.0    PASS    DP=50;AF=0.25
chr1    2000    rs1234  T       C       99.0    PASS    DP=120;AF=0.5

VCF 质控最容易出问题的点：FILTER 列。很多 VCF 会把所有位点都标记为 PASS，但实际质量很差。我见过一个 VCF，里面 90% 的位点支持深度只有 3，但 FILTER 列全是 PASS，因为过滤条件写得太宽松。所以做批次质控时，我习惯按 DP>=10 && QUAL>=30 && MQ >= 40 先硬过滤一波。

4.7 各格式核心区别一览

4.8 格式间的“说话”方式：转换与质控流程

我画了一张图，把六种格式放在一个工作流里，你看看它们是怎么串起来的：

看到没？FASTA 和 FASTQ 是输入，比对后变成 BAM（二进制 SAM），然后再根据你的目的生成 BED、注释（GFF3/GTF）或 VCF。质控需要贯穿全程：上游 FASTQ 质量不行，下游 VCF 就不准；参考基因组 FASTA 有错，注释的 GFF3 坐标就全跑偏。