2、测序数据格式基础：FASTQ、BAM、SAM、CRAM格式介绍及质量指标

做生信分析，说白了就是在跟这几种文件格式打交道。我记得刚入行那会儿，拿到一批测序数据，对着.fastq、.sam、.bam这些后缀一头雾水——每个文件里存的什么信息？为什么同一种数据要存成这么多花样？踩过坑之后才明白，搞懂这些格式是做好质控的第一道门槛。

2.1 FASTQ格式：最原始的测序数据

FASTQ是测序仪直接吐出来的原始格式，你拿到的第一手数据就长这样。它每4行记录一条测序read：

• 第1行：以@开头，是read的唯一标识符，包含测序仪器、flowcell编号、坐标等信息
• 第2行：碱基序列（A/T/C/G/N）
• 第3行：以+开头，通常只重复第1行的标识符（可省略）
• 第4行：质量值字符串，每个字符对应第2行中一个碱基的测序质量

举个例子：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG
CTCAAGGTTGTTGCAAGACGGGAGGTAGGTGTCTCTGGGTAGAAAGCTCT
+
;;C;;;C;;;;;A;D?D?DD?C?D?DDDDAADDD?A?CDDDDDD?

质量值怎么算的？ 我刚开始也觉得复杂，其实就是一个转换公式：

Q = -10 × log₁₀(P)  
其中P是碱基识别错误的概率。
如果Q=30，表示错误概率为0.001，即准确率99.9%。

2.2 质量指标：如何评估测序质量

质量值编码体系也得注意。不同版本的测序仪用过不同编码：

Q = ASCII码值 - 质量偏移量  

Sanger/Illumina 1.8+（Phred+33）：  
质量偏移量 = 33，ASCII 33-126对应Q 0-93  

Illumina 1.3-1.7（Phred+64）：  
质量偏移量 = 64，ASCII 64-126对应Q 0-62  

所以看到质量值字符串里出现"!"、"0"、"B"这些字符时，我就得先确认编码版本，否则读出来的Q值全是错的。

2.3 SAM/BAM格式：比对结果的标准存储

FASTQ经过比对之后，会生成SAM（Sequence Alignment/Map）格式。这玩意儿是纯文本，可读性不错，但文件体积大得吓人。BAM就是它的二进制压缩版，体积小、加载快，是实际工作里的主力。

我以前踩过一个坑：拿到一个50G的SAM文件，想直接读进来分析，结果内存直接爆掉。从那以后，我养成了习惯——任何时候接到比对结果，第一件事就是先看是SAM还是BAM。如果是SAM，二话不说先转成BAM：

samtools view -bS sample.sam > sample.bam  
samtools sort sample.bam -o sample.sorted.bam  
samtools index sample.sorted.bam  # 建索引才能随机访问

SAM文件的结构，说白了就两大块：

• 头部（Header）：以@开头，记录参考基因组版本、比对参数、reads分组等信息
• 主体（Alignment）：每一行是一条read的比对结果，包含11个必填字段加可选标签

关键字段我得提一下：

2.4 CRAM格式：更高压缩比的替代方案

CRAM是BAM的升级版，压缩率能再砍掉30%-50%。它的核心思路是：不直接存碱基序列，而是存与参考基因组的差异。所以CRAM文件必须依赖一个参考基因组才能解压。

什么时候该用CRAM？我个人的判断标准是这样的：

• 长期归档：数据存三年五年，CRAM能省一大笔存储费
• 云上传输：几十G的BAM传起来要命，CRAM能快不少
• 参考基因组稳定：如果你用的参考版本经常换，CRAM的解压就麻烦了

用最常用的工具操作一下：

# BAM转CRAM（指定参考基因组）
samtools view -C -T reference.fasta input.bam -o output.cram

# CRAM转BAM
samtools view -b -T reference.fasta input.cram -o output.bam

# 直接统计CRAM的比对信息
samtools flagstat input.cram

2.5 知识体系总览

说了这么多，其实这几种格式的关系很简单。我画了张图帮大家理清思路：

这几种格式不是孤立的，它们是数据流动中不同阶段的产物。我建议大家在实际工作中，建立起"格式即状态"的意识——看到什么后缀，就知道数据走到哪个环节了，质控该关注什么点。比如看到FASTQ，脑子里就蹦出Q30；看到BAM，第一反应是check MAPQ和比对率。