📚 课程目录第4章原始文件准备

原始文件准备：从命名到分组，一个都不能错

做蛋白质组学的人，谁没被“文件找不到、分组乱套、跑完MaxQuant才发现批次混了”折磨过？

我最早入行时，接过一个多批次的磷酸化组学项目。当时实验室的命名风格是“日期+人名+随机数字”，结果MaxQuant分组用了两天，最后发现某个批次文件重名覆盖了……嗯，从那以后我订了一套硬规则。

这一节，我就把这几条硬规则拆开讲。看似是“脏活”，但批次一致性好不好，80%取决于RAW文件怎么摆、怎么命名、怎么分组。

1. 命名规范——给RAW文件一个“身份证号”

一个好名字，不需要打开文件就知道：哪个项目、哪台质谱、第几批、什么样品、第几次重复。

我的推荐格式：

项目_日期_仪器_批次_样品类型_样品编号_重复序号.raw

举个例子：

字段	示例值	说明
项目	CRC_exosome	结直肠癌外泌体项目
日期	20240528	采集日期，8位数字
仪器	QE_plus	Q Exactive Plus
批次	B02	Batch 02，两位数字
样品类型	ctrl	对照组，用缩写
样品编号	P012	样品唯一ID
重复序号	R03	技术重复3

完整名称：

CRC_exosome_20240528_QE_plus_B02_ctrl_P012_R03.raw

为什么要加批次号？

我在一个多中心项目中遇到过：两家合作方用的命名几乎一样，只是质谱型号不同。结果MaxQuant的Experiment列里批号丢失，导致后续批次效应校正时根本无法追溯。改了两个月脚本……后来我们强制在文件名里塞进B01、B02，再没出问题。

避坑指南：

文件名里绝不能用中文、空格、特殊符号（下划线可以，连字符建议只用单下划线）。
日期统一用ISO格式：YYYYMMDD，不要写成2024-5-28或28/05/2024——排序会乱。
重复序号建议两位数：R01、R02……这样字母排序和数字排序一致。

2. 文件夹组织——像整理衣柜一样整理RAW文件

我个人习惯分三层。

顶层：项目根目录

CRC_exosome/

第二层：按批次分

CRC_exosome/
  batch01/
  batch02/
  batch03/

第三层：每个批次内按日期/仪器区分（可选）

batch01/
  20240528_QE_plus/
  20240601_QE_plus/

当然，如果你的项目只有一个仪器，第二层直接放RAW文件就行，不必再套一层日期。但批次目录必须存在。

为什么？

因为MaxQuant的Raw file locations对话框是按文件夹加载的。如果你把所有批次的RAW文件塞在一个文件夹里，Experiment列只能靠解析文件名来区分批次——这本身就增加了出错概率。而且一旦你需要在后续步骤（如DIA-NN）中用Fraction或SampleID做批次区分，文件夹结构的优势就出来了：你只需要在参数配置里指定Raw data folder为批次父文件夹，MaxQuant会自动把子文件夹名当作分组标识。

小技巧：

在batch目录下放一个README.txt或batch_notes.txt，记录该批次的采集参数、工作日、湿度、色谱柱状态。有时候批次效应不是仪器漂移，而是那天下雨室温波动导致的。我在整理Eclipse数据时就靠这些备注锁定了原因。

3. 实验分组设计——MaxQuant的“group”不是给你随便起的

MaxQuant的分组逻辑其实很简单：每个RAW文件必须属于唯一一个Experiment组。而这个组，通常对应你的实验条件（control vs treatment, time point 0h vs 6h, tissue A vs B）。

但很多新手把Experiment直接设成文件名或批次号——这其实浪费了分组能力。正确的做法是：

Experiment： 只反映生物学变量，如“Ctrl_6h”、“Treated_6h”。
Fraction： 如果用了馏分分离，同一个样品的不同馏分填同一个Fraction值（如1,2,3……），让MaxQuant知道它们是同一份样品分出来的。
批次： 通过文件夹单独组织，或写在文件名里，在后续分析阶段（如R/Python脚本）手动引入批次协变量。

我的经验：

我做了一个简单的“分组设计表”，每次都和实验记录一起保存。格式如下：

RawFile	Experiment	Fraction	Batch	SampleID
CRC_B02_ctrl_P012_R01	Ctrl	1	B02	P012
CRC_B02_ctrl_P012_R02	Ctrl	1	B02	P012
CRC_B02_treat_P013_R01	Treated	1	B02	P013
CRC_B03_treat_P013_R01	Treated	1	B03	P013

这张表里，P013样品在B02和B03批次都出现了，这是为了评估批次效应特意做的“桥接样品”（bridge sample）。这种设计在MaxQuant里不需要特殊处理，但后续差异分析时，SampleID可以帮你做paired test或交叉验证。

注意： 同一份样品的多个技术重复，Experiment必须相同，否则MaxQuant会认为它们是不同样品，导致定量无法合并。

整体流程一张图

下面这张SVG把从“原始RAW文件”到“MaxQuant可读分组”的常规路线串了起来。你可以对照自己的项目检查每一步。

我个人建议：在开始任何MaxQuant分析之前，把这张图贴在实验室白板上。每一条RAW文件从命名到加载，都走一遍这个流程。我发现只要把“分组设计表”提前做好，后面批次效应校正其实只需要一行代码。

最后分享一个实用脚本：

我习惯用Python自动生成分组表。假设你的RAWe命名规范固定，这个脚本可以省去人工填表的时间：

import os, re
from pathlib import Path

raw_dir = Path("CRC_exosome/batch02")
rows = []
for f in raw_dir.glob("*.raw"):
    # 文件名：项目_日期_仪器_批次_类型_ID_重复
    parts = f.stem.split('_')
    experiment = parts[4]  # 例如 'ctrl' 或 'treat'
    fraction = 1 if 'frac' not in f.stem else re.findall(r'frac(\d+)', f.stem)[0]
    batch = parts[3]
    sample = parts[5]
    rows.append(f.stem, experiment, fraction, batch, sample)

# 输出制表符分隔的表格，可直接粘贴到MaxQuant的experimentalDesignTemplate.txt
for r in rows:
    print(f"{r[0]}\t{r[1]}\t{r[2]}\t{r[3]}\t{r[4]}")

执行后会生成类似的内容：

CRC_B02_ctrl_P012_R01	Ctrl	1	B02	P012
CRC_B02_ctrl_P012_R02	Ctrl	1	B02	P012
CRC_B02_treat_P013_R01	Treated	1	B02	P013

把这张表复制到experimentalDesignTemplate.txt，MaxQuant就能正确理解你的分组了。

好了，这一节的内容就是这些。记住：数据准备越规范，你的分析越省心。下一次当你面对几十个RAW文件时，不妨按这套框架走一遍，我保证你会回来感谢现在的自己。