📚 课程目录第3章数据准备

3. 数据准备：从 10X Genomics 下载示例数据、构建 Seurat 对象、质量控制流程

好，咱们进入实操环节。这一章会带你走一遍标准的数据准备流程。说白了，就是把 10X 的原始数据变成能分析的 Seurat 对象。这部分我做过太多次了，有些坑不亲自踩一遍还真不知道。

3.1 从 10X Genomics 获取示例数据

我习惯直接使用 10X Genomics 官方提供的 pbmc3k 数据集做测试。这个数据集不大，跑起来快，适合拿来验证参数效果。你可以通过 SeuratData 包自动下载，也可以手动去官网拉。

用 SeuratData 安装（推荐方式）：

install.packages("Seurat")
install.packages("SeuratData")
library(SeuratData)
InstallData("pbmc3k")

这样一来，数据就自动下载并缓存到你本地了。我个人觉得这是最省心的方式，尤其当你需要反复重建分析环境时。

手动下载（要是你网络不好可以用这个）：

# 去 10X Genomics 官网找到 "pbmc3k" 数据集
# 或者直接用这个链接（注意版本）
# https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz
# 解压后你会得到三个核心文件：
#   barcodes.tsv.gz
#   features.tsv.gz
#   matrix.mtx.gz

注意： 我曾遇到过用 SeuratData 下载时，包版本不匹配导致数据文件读取失败的情况。建议先更新 SeuratData 到最新版。

3.2 构建 Seurat 对象

数据下载好了，下一步就是构建 Seurat 对象。这是之后所有分析的基础容器。我会用 Read10X() 函数来读取数据，然后传给 CreateSeuratObject()。

library(Seurat)
library(dplyr)

# 读取数据（注意路径）
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "path/to/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")

# 构建 Seurat 对象
pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts = pbmc.data,
  project = "pbmc3k",
  min.cells = 3,
  min.features = 200
)

这里我解释一下两个关键参数：

min.cells = 3： 只保留在至少 3 个细胞中检测到的基因。这能过滤掉那些极低表达、可能只是噪音的基因。
min.features = 200： 只保留检测到至少 200 个基因的细胞。空液滴或破裂的细胞通常基因数很少，这一步能帮你排除它们。

你想想看，这两个参数像是两道筛子。一个筛掉基因，一个筛掉细胞。我在项目中遇到过有些实验室的样本质量低，min.features 得调到 500 才行。所以这些值不是死数字，要看你的数据质量。

3.3 质量控制流程

构建完对象，咱们得做一次彻底的质量检查。QC 的核心是识别并剔除不合格的细胞。我通常会关注三个指标：

nCount_RNA — 每个细胞的 UMI 总数
nFeature_RNA — 每个细胞检测到的基因数
percent.mt — 线粒体基因表达占比

先算线粒体比例：

pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(
  pbmc,
  pattern = "^MT-"
)

嗯，这里要啰嗦一句。人源的线粒体基因以 ^MT- 开头，小鼠是 ^mt-。别搞混了，否则你算出来的比例全是 0。我刚开始做的时候就犯过这个错。

可视化 QC 指标：

我个人习惯先用小提琴图看看数据分布，心里有个底。

# 画三个 violin 图
VlnPlot(
  pbmc,
  features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
  ncol = 3,
  pt.size = 0.1
)

图像出来后，你会发现大部分细胞集中在某个范围，但总有一些离群值。这些离群值就是我们要砍掉的。

设定过滤阈值：

这步没有标准答案。我一般会根据可视化结果来定。下面是一个比较通用的设置：

# 过滤细胞
pbmc <- subset(
  pbmc,
  subset = nFeature_RNA > 200 &
           nFeature_RNA < 2500 &
           percent.mt < 5
)

这张表总结了过滤逻辑：

指标	阈值	剔除原因
nFeature_RNA	> 200	基因数太少，可能是空液滴或死细胞
nFeature_RNA	< 2500	基因数太多，可能是双细胞（两个细胞被同一个液滴捕获）
percent.mt	< 5%	线粒体比例高，通常是细胞受损或正在凋亡

小技巧： 如果你处理的样本质量很差（比如长期保存的组织），把 percent.mt 的上限放宽到 10-15% 可能更实际。完全卡在 5% 会把太多细胞丢掉。我亲身经历过一次，样本几乎报废，最后靠放宽阈值才保住了分析。

3.4 本章知识脉络图

下面这张 SVG 把数据准备的全流程串起来了。从原始数据到干净的 Seurat 对象，一目了然。

从图里你能看到，数据准备是串联的流程。每多一个正确的参数，你的数据就更接近真实生物学信号。

3.5 本章小结

这一章我们走了三步：

下载数据：用 SeuratData 或手动拉取 pbmc3k
构建对象：Read10X() + CreateSeuratObject()，设好初步过滤
质量控制：算 nFeature/nCount/percent.mt，用 subset() 砍掉坏细胞

这些操作看起来基础，但我敢说，很多 batch effect 问题其实在 QC 阶段就埋下了种子。如果过滤标准不一致，后面的批次校正就是你使劲给模型擦屁股。所以，花时间把这一步做扎实，绝对值得。