2. 富集分析基本原理归纳总结

讲气泡图解读前，咱得先把地基打牢。

富集分析到底在干什么？说白了，就是回答一个问题：你找到的那堆差异基因，是不是碰巧凑在一起的？

我个人刚接触生信时，总觉得这步就是跑个软件、出个图就完事了。后来被审稿人追问过两次方法学细节……嗯，从那以后我每次讲课时都要把原理掰开了说。

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2.1 核心逻辑：从“基因列表”到“通路故事”

你手头有一个差异表达基因列表，比如100个上调、80个下调。现在你想知道这些基因主要参与了哪些生物学过程。

富集分析帮你做的，就是把这堆基因往已知的KEGG通路上“贴标签”。

1. 第一步：定义背景集——所有被测到的基因（比如人的两万个蛋白编码基因）。
2. 第二步：定义兴趣集——你筛选出来的差异基因。
3. 第三步：逐个通路问——这个通路里的基因，在兴趣集里出现了几次？是比随机预期多，还是少？

举个例子你就明白了。

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2.2 数学基础：超几何分布与Fisher精确检验

富集分析最常用的统计学模型，是超几何分布。别被名字吓到，公式其实很好理解。

符号	含义
N	背景基因总数（比如所有被检测到的基因数）
M	该通路包含的基因数
n	你兴趣集里的基因总数
k	兴趣集中落在这个通路里的基因数

检验的问题是：在兴趣集中看到k个或更多通路基因的概率有多大？如果概率很小（p < 0.05），我们就说这个通路显著富集了。

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2.3 一个关键概念：背景构成

背景集的选择，直接决定你的结果准不准。

我遇到过不少初学者，背景集直接用全部基因组。其实不对。你的背景集应该是本次实验中所有检测到的基因，而不是整个物种的基因。

• 全部基因组作为背景：会导致检测到的基因偏向表达丰度高的通路——因为你根本没测到低表达基因。
• 实测基因集作为背景：更准确，更符合实验实际情况。

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2.4 p值与多重假设检验校正

你同时检验了几百条通路。p < 0.05意味着每检验20条通路就有1条可能是假的。所以必须校正。

常用的校正方法有：

方法	特点	适用场景
Bonferroni	最严格，直接p * 通路数	通路数量少（< 50）时可用
BH（FDR）	控制假发现率，较宽松	主流方法，推荐使用
BY	比BH更保守	需要极低假阳性时

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2.5 富集分析的两种常见模式

我稍提一句，画气泡图前你得知道自己用的哪种模式。虽然图看起来很类似，但解读逻辑有差别。

1. Over-Representation Analysis（ORA）：只判断通路是否在兴趣基因集中显著出现。最常见。
2. Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）：用所有基因的排序信息，不设阈值。灵敏度更高。

气泡图大部分基于ORA结果。GSEA更多画条形图或Ridge图。

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2.6 本章核心知识图谱

下面这张图，把上面讲的逻辑串了一遍。

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2.7 解读富集结果时，我关注什么？

回到气泡图本身。

气泡图展示的是显著富集的通路。你看到图上每个气泡对应一个通路。但背后支撑它的，就是上面这一整套逻辑。

• 气泡大小：通常是富集到该通路的基因数（count）或比例。
• 气泡颜色：代表p值或FDR的显著性。颜色越深，越显著。
• 横坐标：Rich factor（富集因子）或GeneRatio。说白了就是兴趣集中落到这个通路的基因占该通路总基因的比例。

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2.8 避坑指南

都是我自己或者学生犯过的错，记下来省得再踩。

• 忘了校正：直接拿原始p值画图。结果出来一堆“显著”通路，一校正全没了。
• 背景集错误：前面强调过了，一定要用实测基因集。
• 通路名望文生义：比如看到“Pathways in cancer”就觉得你的数据跟癌症有关。其实很多通路是基础代谢通路，在不同条件下都会富集到。
• 只看p值不看富集因子：p值显著但富集因子很低，说明富集强度不够，生物学意义有限。具体怎么判断，下一章讲气泡图时会细说。