3、Trimmomatic基本用法：命令行结构、输入输出文件、运行示例

Trimmomatic 这东西，说白了就是一条命令搞定一套质控流程。但刚接触的人往往卡在参数顺序上，动不动就报错。我刚开始用的时候也栽过跟头，后来摸清了它的脾气，才算真正上手。今天咱们就把它的命令行结构、文件命名规则和典型运行姿势一次性说透。

3.1 命令行骨架

Trimmomatic 的命令格式挺固定的，分单端 (SE) 和双端 (PE) 两种模式。我个人习惯先在脑子里画个草图：输入几个文件，输出几个文件，中间插哪些步骤。你想想看，如果命令写错了，跑半天才发现，多耽误事。

基础模板长这样：

TrimmomaticPE  [输入文件1] [输入文件2] [输出文件1_paired] [输出文件1_unpaired] [输出文件2_paired] [输出文件2_unpaired] [步骤参数...]

TrimmomaticSE  [输入文件] [输出文件] [步骤参数...]

注意：双端模式下，你必须给出四个输出文件名，缺一不可。我曾经见过有人只写了两个，结果程序直接报错退出。

参数含义
TrimmomaticPE双端模式 (Paired‑End)
TrimmomaticSE单端模式 (Single‑End)
输入文件1左端 (R1) FASTQ
输入文件2右端 (R2) FASTQ（PE模式必需）
输出文件*_paired配对成功的 reads
输出文件*_unpaired单端存活（另一半被丢弃）的 reads

3.2 输入输出文件的命名规矩

很多人觉得文件名随便写就行，其实不然。Trimmomatic 严格按照你给的路径读取和写入，不会自动加后缀。我建议你养成一套命名习惯，比如：

  • 原始文件：sample_R1.fastq.gz、sample_R2.fastq.gz
  • 输出文件：sample_R1_trimmed_paired.fastq.gz、sample_R1_trimmed_unpaired.fastq.gz……

这样一看就知道哪些是配对的，哪些是孤儿 reads。嗯，这里要注意：压缩格式必须和实际一致，Trimmomatic 会根据 .gz 后缀自动判断是否用 gzip 读写。要是你文件是 gz 但没写 .gz，它会当纯文本读，速度慢不说，还可能把二进制数据搞乱。

我的小技巧： 用 _paired 和 _unpaired 做后缀，脚本后面处理起来特别省事，grep 一把就能找到。

3.3 一个完整的双端运行示例

拿我最常用的参数组合举个例子。假设我要对肿瘤样本的 FASTQ 做质控，去掉 adapter、切除低质量尾巴、滑动窗口过滤，最后丢弃掉太短的 reads。命令如下：

TrimmomaticPE \
  tumor_R1.fastq.gz tumor_R2.fastq.gz \
  tumor_R1_trimmed_paired.fastq.gz tumor_R1_trimmed_unpaired.fastq.gz \
  tumor_R2_trimmed_paired.fastq.gz tumor_R2_trimmed_unpaired.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRAILING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

解释一下：

  • ILLUMINACLIP – 去除 adapter，我这里用 TruSeq3-PE 库。参数 2:30:10 依次是错配数、比对分值阈值、最小匹配长度。记不太清？没关系，我后面会专门讲 adapter 调优。
  • LEADING:3 – 切除开头质量低于 3 的碱基。
  • TRAILING:3 – 切除结尾质量低于 3 的碱基。
  • SLIDINGWINDOW:4:15 – 滑窗大小 4，平均质量低于 15 就切掉。
  • MINLEN:36 – 切除后 reads 不足 36bp 的直接扔掉。

关键点： 步骤的顺序不能乱！Trimmomatic 严格按照命令中写的先后顺序执行。ILLUMINACLIP 通常放第一个，因为 adapter 残留会影响后面质量判断。我一开始把 LEADING 放前面，结果 adapter 没去掉，后面窗口过滤把好序列给切坏了。

3.4 单端模式怎么跑

单端简单很多，只有一对输入输出。我有时处理混池样本或者长片段扩增子时用 SE 模式。示例：

TrimmomaticSE \
  amplicon_R1.fastq.gz \
  amplicon_trimmed.fastq.gz \
  LEADING:3 TRAILING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:20 \
  MINLEN:50

这里我把滑窗阈值设成 20，因为扩增子质量要求高一点。你酌情调整。

3.5 软件执行流程总览

下面这张图概括了 Trimmomatic 双端模式从输入到输出的完整路径。我故意把 "unpaired" 的输出画成虚线，表示它们是孤儿，后续用还是不用得看实验设计。

Trimmomatic PE 流程结构 R1.fastq.gz (左端) R2.fastq.gz (右端) Trimmomatic ILLUMINACLIP LEADING / TRAILING / SLIDINGWINDOW R1_paired (保持配对) R1_unpaired (孤儿) R2_paired (保持配对) 说明： R1 和 R2 各自产出 paired 和 unpaired 文件 unpaired 文件中的 reads 已丢失另一半，可能影响下游分析

3.6 常见坑和你该注意的地方

我曾经踩过的坑：

  • 输出文件路径写错： 有一次我把输出目录写成了不存在的位置，Trimmomatic 不会自动创建目录，直接报错。建议先 mkdir -p 好输出目录。
  • 输入文件顺序搞反： PE 模式下第一个参数必须是 R1，第二个才是 R2。我见过有人颠倒，结果输出的 paired reads 两端完全对不上号。
  • 参数值带空格： 比如 SLIDINGWINDOW:4:15 中不能有空格，否则会被当成新参数。

其实说到底，Trimmomatic 的用法并不复杂，核心就三条：

  1. 记清 PE / SE 的输入输出格式。
  2. 按 adapter → 切头 → 切尾 → 滑窗 → 最小长度的顺序写步骤。
  3. 运行时先在小样本上试跑，确认命令行没问题再批量提交。

我个人习惯写一个 shell 脚本模板，每次改改样本名和参数就行。这样既不容易写错，也方便下次复用。你可以参考下面这个框架：

#!/bin/bash
# trimmomatic_demo.sh

SAMPLE=$1
R1=${SAMPLE}_R1.fastq.gz
R2=${SAMPLE}_R2.fastq.gz
OUTDIR=./trimmed

mkdir -p $OUTDIR

TrimmomaticPE \
  $R1 $R2 \
  $OUTDIR/${SAMPLE}_R1_paired.fastq.gz $OUTDIR/${SAMPLE}_R1_unpaired.fastq.gz \
  $OUTDIR/${SAMPLE}_R2_paired.fastq.gz $OUTDIR/${SAMPLE}_R2_unpaired.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRAILING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

调用的时候直接 bash trimmomatic_demo.sh tumor_sample，省心省力。

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