📚 课程目录第3章 FastQC输入与输出

3、FastQC输入与输出：支持的输入格式与报告结构

好了，到了动手跑FastQC的时候了。不过你得先搞清楚它能吃什么格式的数据，以及吃完后拉出来的报告长什么样。我最早用FastQC的时候，直接拿.bam文件往里塞，结果报错——后来才发现我用的版本不支持。嗯，这坑我替你们踩过了。

3.1 支持的输入格式

FastQC吃三种格式：FastQ、SAM、BAM。说白了就是测序仪出来的原始数据，以及比对软件生成的中间文件。不过要注意，不是所有SAM/BAM它都爱吃。

FastQ格式

这是最常见的格式。每条read包含四行信息：标识符、序列、分隔符（+）、质量值。

@SEQ_ID_1
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT
+
!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65

我个人习惯是，拿到新项目先看一眼FastQ文件的行数，确认是4的倍数。如果不是，那多半是上传时被截断了。

小技巧：检查FastQ完整性可以用一条简单的shell命令：

lines=$(wc -l < sample.fastq)
echo $((lines % 4))
# 输出0才正常

你想想看，如果文件损坏了，后面的质控结果全是错的，那不是浪费时间嘛。

SAM格式

SAM是比对后的文本格式，FastQC只支持单端或双端比对产生的SAM文件。它要求文件是有序的，并且包含完整的header信息。

@HD     VN:1.6  SO:coordinate
@SQ     SN:chr1 LN:248956422
@PG     ID:bwa  PN:bwa  VN:0.7.17
read1   99      chr1    10001   60      150M    =       10250   399
read2   147     chr1    10250   60      150M    =       10001   -399

有一次我拿到客户的数据，他的SAM文件头里没写@SQ信息，FastQC直接崩了。后来我让他重新跑一遍bwa，加上-R参数就好。遇到这种问题，先检查文件头。

避坑提醒：SAM文件一般很大，建议先压缩再传输。但FastQC不能直接吃压缩后的SAM，需要解压。我一般都转成BAM再处理，省得折腾。

BAM格式

BAM是SAM的二进制版本，体积小、读取快。FastQC吃BAM文件时，会自动检测是否包含索引文件（.bai）。如果有索引，它就能按需读取，速度能快不少。

使用BAM输入时，我建议加上--noextract参数，这样FastQC不会解压整个文件，能节省大量内存。

fastqc sample.bam --noextract

关键区别：FastQ是原始数据，SAM/BAM是比对后数据。若用BAM做质控，得到的是比对后的序列质量，跟原始质量不完全一样。做文库评估时建议用FastQ，做比对效率评估时用BAM。

3.2 输出HTML报告结构概览

FastQC输出的HTML报告，说白了就是一个长得规规矩矩的网页。左侧是模块列表，右侧是具体内容。报告里有11个模块，每个模块对应一项质控指标。

下面这个表格，是我整理出来的报告结构框架，你对照着看就清楚了。

模块编号	模块名称	核心检查内容
1	Basic Statistics	文件总reads数、序列长度、GC含量等基础统计
2	Per Base Sequence Quality	每个碱基位置的Q值分布
3	Per Tile Sequence Quality	测序芯片每个tile区域的碱基质量
4	Per Sequence Quality Scores	所有reads平均质量的分布
5	Per Base Sequence Content	每个碱基位置A/T/G/C的比例
6	Per Sequence GC Content	每条read的GC含量分布
7	Per Base N Content	每个碱基位置N的比例
8	Sequence Length Distribution	序列长度分布情况
9	Sequence Duplication Levels	序列重复度水平
10	Overrepresented Sequences	过度代表序列的检测与注释
11	Adapter Content	接头序列污染检测

每个模块会用三种颜色标记状态：绿色（通过）、黄色（警告）、红色（失败）。这些阈值的设置方法，我们后面章节会细讲。

3.3 报告的核心逻辑图

这张图展示的是FastQC从输入到输出的完整流程，以及报告内部各模块之间的逻辑关系。你看看，是不是一目了然。

你看，左边是输入，中间是计算引擎，右边吐出来的是带11个模块的HTML报告。每个模块里都有图形和统计表，顶部还有个整体评估的状态条。

个人经验：我一般在跑完FastQC后，先看报告顶部的“Summary”栏。如果所有模块都是绿色，那恭喜你，数据质量很好。如果出现红色，那就得点进去看具体是什么问题。别急着调参数，先弄清楚问题原因。

3.4 报告的基本元素

每个模块的报告页包含这几部分内容：

模块标题：比如“Per Base Sequence Quality”
状态指示：绿色勾（Pass）、黄色感叹号（WARN）、红色叉（FAIL）
统计图：大多数模块都有对应的分布图或热图
表格数据：如果图形不够详细，下方会附加数值表格
说明文字：FastQC会给出简短的模块解释

举个例子，打开“Per Base Sequence Quality”这个模块，你会看到一张箱线图。横轴是碱基位置，纵轴是Q值。每个位置都有个盒子，盒子的中线代表中位数，上下边缘代表四分位数。正常数据应该是大部分位置Q值在30以上。

# 快速查看报告摘要（命令行版）
unzip -p sample_fastqc.zip fastqc_data.txt | head -30

这个命令可以直接从压缩包中提取核心数据，不用打开网页。我经常在服务器上这么干，省得下载HTML。

提示：不同版本的FastQC生成的报告结构基本一致，但偶尔会有细微差别。比如老版本没有“Per Tile Sequence Quality”这个模块。使用时建议更新到最新版，目前是v0.12.x。

3.5 关于输出的那些坑

说几个我遇到过的实际问题：

FastQC默认输出到当前目录，如果你在数据盘跑，报告会写在数据盘上。建议加上-o参数，指定输出目录。
如果输入的是BAM文件，FastQC会把索引文件（.bai）自动找出来。要是没有索引，它会提示“No index file found”，但依然能跑，就是慢一些。
报告里的图是嵌入的SVG和PNG，你可以直接右键另存为图片。不过我个人习惯用fastqc -f fastq生成纯文本输出，然后用其他工具画图，灵活度更高。

# 指定输出目录示例
fastqc sample.fastq -o /path/to/output/

嗯，关于输入输出这部分，记住一句话：给的格式要对，输出的报告要会看。格式错了白跑，报告看不懂等于没跑。后面几章我们会逐个模块深入拆解，每个指标怎么解读、阈值怎么设，都会有具体案例。先把这个基础打好。