2. 单细胞RNA-seq数据预处理流程归纳总结

预处理是单细胞RNA-seq分析的地基。地基没打牢，后面所有批次校正、聚类、差异表达全是白搭。我个人习惯是，拿到新数据后先拉一遍完整的预处理管线，再回头看样本质量。今天我就把这套流程拆开来给你捋一遍。

2.1 原始数据到表达矩阵：核心三步

先说大框架。不管你用10x、Smart-seq2还是Drop-seq，最终都要走到同一个目标：把测序仪吐出来的fastq文件，转成基因×细胞的计数矩阵。我把它总结成三条主线——

步骤	输入	输出	常用工具
1. 原始数据质控	fastq	clean fastq	FastQC, fastp, Cutadapt
2. 比对/定量	clean fastq + 参考基因组	BAM / 基因-UMI计数	STARsolo, Cell Ranger, kallisto|bustools
3. 生成计数矩阵	基因-UMI计数文件	cells × genes 稀疏矩阵	Cell Ranger output, emptyDrops

嗯，你可能要问：为什么跳过比对直接定量也行？因为现在很多工具是pseudo-alignment（伪比对），比如kallisto，速度是STAR的5-10倍，准确度并不差。我在项目里试过STARsolo和kallisto，对肿瘤样本这种高异质性的数据，两种方法的结果差异很小，但kallisto跑得快多了。

2.2 细胞筛选：别把垃圾当宝贝

矩阵拿到了，第一件事不是急着分析，而是把空液滴、死细胞、双细胞踢出去。这个环节我吃过亏——有次肿瘤样本里混了大量血小板黏连的颗粒，结果聚类出来一个“假亚群”，折腾了两周才发现是双细胞。避坑建议从这里开始。

常用的过滤指标有三个：

• 基因数（nFeature_RNA）：一般200-2500之间。肿瘤细胞往往表达多样，上限可以放宽到4000。
• UMI数（nCount_RNA）：与基因数高度相关，一般去双细胞时会用它做联合筛选。
• 线粒体比例（percent.mt）：死细胞会漏出线粒体RNA，通常阈值设在10%-20%。肿瘤样本我建议放到15%——因为肿瘤细胞代谢旺盛，线粒体表达本来就高。

下面是我常用的一组过滤代码（Seurat风格），你可以直接套用：

# 过滤低质量细胞（单样本）
selected_cells <- which(
  pbmc$nFeature_RNA > 200 &
  pbmc$nFeature_RNA < 4000 &
  pbmc$percent.mt < 15
)
pbmc <- pbmc[, selected_cells]

2.3 标准化与归一化：让细胞之间能比较

原始UMI counts受测序深度影响很大——某个细胞测了5万reads，另一个只测了1万，单纯比counts是不公平的。标准化就是把这个坑填平。

主流的标准化方法分两大派：

方法	核心思想	适用场景
LogNormalize (Seurat默认)	每个细胞的counts除以总counts，乘以scale.factor，再log1p	快速、内存友好，适合初步探索
SCTransform	用负二项回归去除深度影响，同时保留生物变异	肿瘤样本（高异质性）、批次效应明显的场景
sctransform + v2	改进版，速度更快，正则化更强	大规模数据集（1万以上细胞）

我个人偏好：如果样本量小于5000细胞，我会用SCTransform，因为它在保留稀有亚群方面明显优于LogNormalize。有一次我在髓系细胞分析中发现，LogNormalize直接抹掉了一个只有0.5%比例的巨噬细胞亚群，而SCTransform能清晰保留。

2.4 高变基因选择：降维前的关键一步

全基因组3万个基因，大部分是“噪音”。我们只取那些在细胞之间表达差异最大的基因（高变基因，HVGs）做后续PCA。这步做不好，降维后全是技术噪声。

Seurat的FindVariableFeatures默认选2000个，你想想看，2000个够用吗？

• 如果样本非常均质（比如纯化的T细胞），1000个就够了。
• 肿瘤样本里细胞类型多、状态复杂，我建议用3000-4000。
• 另外，选择方法上我常用vst（基于方差稳定变换），对0膨胀的数据处理得更好。

# Seurat 高变基因选择（vst方法，取3000个）
pbmc <- FindVariableFeatures(
  pbmc,
  selection.method = "vst",
  nfeatures = 3000
)

2.5 PCA与UMAP：把高维塞进二维

标准化后的表达矩阵仍然是高维的（细胞数×高变基因数）。我们需要降维。

PCA是线性降维，保留全局结构。一般取30-50个主成分。多少合适？跑一个ElbowPlot，看拐点在哪。我习惯取50个——多几个主成分不会引入太多噪声，但能保留更细的变异。

UMAP是非线性降维，专门用于可视化。UMAP的参数里，n.neighbors和min.dist对肿瘤异质性展示影响很大。我记得有次调整n.neighbors从15降到5，一个原本被埋没的应激反应亚群忽然就分开了。

# PCA + UMAP 标准流程（Seurat）
pbmc <- RunPCA(pbmc, npcs = 50)
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:50)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.8)
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:50, n.neighbors = 10, min.dist = 0.3)

2.6 预处理全流程SVG总览

下面这张图把以上五个环节串成一条管线。你可以把它贴在工位旁，每次跑数据前扫一眼，保证不丢步骤。

2.7 预处理常见坑（以及我怎么爬出来的）

做肿瘤样本预处理这些年，我至少在以下三个地方摔过跟头：

1. 双细胞过滤太松：肿瘤细胞本身个头大、表达丰度高，容易形成异型双细胞。我用DoubletFinder检测后发现，未经任何处理的样本里双细胞比例竟高达8%。后来我在过滤步骤之前，专门跑了一遍scrublet。
2. 忽略线粒体RNA的肿瘤生物学意义：前面说线粒体阈值设在15%，但如果是缺氧肿瘤区域，线粒体基因激活可能本身就是生物信号。我建议做一个“高线粒体细胞子集”的单独分析，不要无脑踢掉。
3. 标准化选择错误：用LogNormalize处理混合肿瘤-正常样本时，由于深度差异大（肿瘤细胞UMI是正常细胞的3倍），会引入严重的批次效应。改用SCTransform后干净多了。