实验设计：样本准备、芯片选择、实验流程

空间转录组学这个事儿，说实话，实验设计的成败决定了你后面所有分析的价值。样品不好，后面全是白费。我做这行这些年，踩过不少坑，今天就把这些经验掰开揉碎了讲给你听。

样本准备：原材料的质量决定一切

空间转录组对样本的要求，比普通转录组苛刻得多。组织要新鲜，保存要及时，切片要平整。我曾经遇到过一次，同事用 OCT 包埋的组织放了半年才来做切片，结果 RNA 降解得一塌糊涂，整个实验白做。

样本获取的核心要点：

• 组织类型：新鲜冰冻组织是最佳选择，FFPE 样本也能做但步骤复杂很多
• 保存方式：取下来后立刻用液氮速冻，转存到 -80°C 冰箱
• 切片厚度：一般 10–20 μm，太薄细胞不完整，太厚透不过 probe
• 切片温度：冰冻切片机温度保持在 -16°C 到 -20°C

你想想看，空间转录组要求保持组织原位结构，同时又要把 RNA 完整保留下来。这两个条件天然就有矛盾——组织要固定好，固定剂又会破坏 RNA。所以必须在固定性和完整性之间找平衡点。

芯片选择：不是越贵越好，合适才重要

选哪家的芯片？别急，我们慢慢理。市面上的主流平台就那么几个：10x Visium、Slide-seq、MERFISH、seqFISH。它们的核心差异在于分辨率和捕获面积。

我个人习惯，第一次做空间转录组时先上 10x Visium。为什么？因为它有成熟的试剂盒，流程文档写得详细，社区大，遇到问题有地方问。等你把管道跑通了，再根据自己的科学问题去换更细分辨率的平台。

芯片参数匹配要记住：

# 一个典型的 10x Visium 芯片参数示例
捕获点直径：55 μm
点间距：100 μm
一个点内 UMIs：约 30,000–50,000
捕获区域：6.5 mm × 6.5 mm
组织切片面积上限：约 40 mm²

这里我特别提醒一下：选择芯片时一定要看芯片的空间条形码设计。每个点都带有唯一的位置编码，你的组织切片要能正好覆盖这些点。如果组织太小，很多点浪费掉；组织太大，超出捕获区域边缘的样本拿不到数据。

实验流程：从切片到文库，每一步都是坑

空间转录组的实验流程，说白了就是把组织切片贴到带条形码的芯片上，原位进行逆转录，然后建库测序。我列一个标准的操作流程，你对着走基本不会出大问题。

1. 组织切片的制备与贴片
   • 切片厚度设定：冰冻切片机调 10–20 μm
   • 贴片动作要快：切片不能卷，不能有气泡
   • 贴好后立刻固定：4% PFA 固定 10–15 分钟
2. 组织透化
   • 这一步决定捕获效率：透化不足 RNA 出不来，透化过头 RNA 扩散到相邻点
   • 用蛋白酶 K 处理，时间需要做预实验优化
   • 我一般做 5、10、15 分钟梯度，看哪个时间点捕获的 UMI 最多
3. 逆转录
   • 原位逆转录，直接把 cDNA 合成在芯片上
   • 逆转录酶用高浓度、高质量的
   • 42°C 孵育 1.5 小时，不能少
4. cDNA 释放与扩增
   • 从芯片上把 cDNA 洗下来
   • PCR 扩增：一般 14–16 个循环，太多会引入 PCR 偏向
5. 文库构建
   • 片段化、末端修复、加 A、连接 adaptor
   • 最后进行索引 PCR 引入样本特异的 index
6. 质量控制
   • 使用 Qubit 和 Bioanalyzer 检测文库浓度和片段大小
   • 文库浓度 ≥ 2 ng/μL，主峰在 300–500 bp

一个典型的透化时间优化实验设计：

# 透化时间梯度
# 组织类型：小鼠大脑冠状切片
# 芯片类型：10x Visium 6.5 mm × 6.5 mm

透化时间点：5 min, 8 min, 12 min, 15 min
每个时间点做一张芯片（或一张芯片上分区）

评估指标：
- 总捕获 UMI 数（越高越好，但无上限）
- 基因种类数（越高越好）
- 空间模式保留度（肉眼观察组织边界染色是否清晰）

优选结果：8 min 捕获 UMI 最高，基因数 4800
                        组织边界最锐利
最终选定：8 min 作为该组织的标准透化时间

嗯，这里要注意：不同组织的最佳透化时间差异很大。肝脏组织细胞膜薄，需要的透化时间短；皮肤或软骨组织细胞外基质多，需要时间长。我建议每个新组织类型都做一次这种梯度实验，虽然多花了点时间和经费，但能避免整批实验翻车。

实验设计模板：拿来即用

最后给你一个我常用的实验设计模板，可以直接套用：

实验设计做扎实了，后面的管道才能顺。说白了，你前面多花一天做透化优化，可能帮你省掉后面两周的分析排错时间。