📚 课程目录第1章课程介绍

1、课程介绍：多批次Visium数据质控的重要性

先讲个我自己的故事。三年前，我接手了一个小鼠大脑的Visium项目。三张切片，三个不同的实验批次。我当时觉得——嗯，不就是合并一下数据嘛，简单。结果呢？聚类图出来，三批样本各自抱团，批次效应把生物学差异吃得干干净净。你说技术重复？分明是三次独立实验。

从那以后，我对质控的态度就变了。多批次Visium数据的质控，不是可选项，是必选项。

Visium的空间转录组数据，一张切片就是一个独立的实验。试剂批次不同、操作人员不同、测序深度不同——这些因素叠加，会让你的数据“长”出很多不该有的差异。

你想想看，三张切片放在同一间实验室，未必能直接比较。

直观对比一下单批次与多批次的数据特征差异：

说白了，如果你忽略批次质控，后续的聚类、差异分析、空间域识别，结果都可能被批次的阴影掩盖。我个人习惯在拿到数据的第一时间就标注批次，哪怕是最简单的“批次列”都不要省。

注意： 不要以为用Harmony或Seurat的整合功能就能一键抹平批次效应。那些工具做的是“校正”，不是“替代质控”。原始数据质量不达标，再好的校正算法也救不回来。

我见过太多人，上来就急着做归一化，连基本的探针质量都没看过。你想想，如果一张切片上有30%的斑点测序深度不足1000 UMI，那这些点放进下游分析，只会成为噪声源。

多批次Visium质控，我个人把它拆成三个目标：

核心原则：先过滤，再整合。 这是我用血的教训换来的经验。先做批次整合再回头剔除低质量点，那些异常点会扭曲校正模型，把你带入一个“看起来整合好了，实际上错了”的陷阱。

一个小技巧： 我个人习惯先用fastqc对原始BAM做一轮测序质量评估，看每个样本的读长质量分布。如果在读长上有明显波动，一定要在后续的SPOT基因计数环节调整参数。

下面这张SVG是我特意画的质控逻辑总览。每次做项目前，我都会对照这张图走一遍，确保没有遗漏。

你看中间的“质控指标计算”节点，这一步是整个流程的“诊断仪”。如果这一步做扎实，后面的过滤和校正是顺水推舟；如果这步走马观花，那后续分析就是在沙滩上盖楼。

我在项目中一般会计算下面这些指标，并且按批次分组可视化，一眼就能看出哪个批次出了幺蛾子。

指标	说明	常用阈值（参考）	批次间关注点
Total Counts（总UMI）	每个斑点捕获的RNA分子总数	> 500 ~ 1000	是否有一个批次整体偏低？
Number of Genes（基因数）	每个斑点检测到的独立基因数	> 200 ~ 500	与总UMI是否一致？
Percent Mitochondrial	线粒体基因UMI占比	< 20% ~ 25%	是否因组织处理不当而整体偏高？
Percent Ribosomal	核糖体基因UMI占比	< 20% ~ 40%	可能存在核糖体RNA捕获偏差
Saturation	测序饱和程度	> 50% ~ 70%	是否因测序深度不足而饱和度太低？

我的经验： 阈值不要照搬文献，一定要结合你当前数据的分布来确定。我通常在过滤前先画一个多组分的箱线图，按批次上色，看阈值在哪能一致地切掉离群点。如果某个批次线粒体比例的箱线顶边明显高于其他批次，我会单独检查那张切片的H&E图像，确认是否存在组织坏死或边缘污染。

我曾经遇到过一个项目，做的是小鼠全脑的Visium分析。三个批次，测序都挺正常。我在过滤时看到一批次的UMI分布偏左，但也没当回事，一梭子跑完了整合流程。结果空间域分析出来，“皮层”区域跨批次比对不上。

回过头我重新做了分批次质控可视化——原来那个批次有一张切片靠近边缘的组织折叠了，测序条件也不好，整张切片的低质量斑点占了35%。放进整合模型后，那些低质量斑点拉偏了Harmony的校正参数，导致两批真实的皮层位置被“拉歪”了。

自那以后，我给自己定了两条硬规矩：