多批次实验设计原则：从根源上控制批次效应

好，咱们聊点实在的。
前面几章把联合分析的基础打好了，现在该啃硬骨头了 —— 实验设计。
说白了，实验设计做不好，后面所有 fancy 的分析都是白搭。

我在这行摸爬滚打了好几年，见过太多人上来就跑分析流程，结果跑出来一堆假阳性。
追问一句“你这几个批次怎么分的？”，对方就愣住了。
嗯，这就是我们今天要解决的核心问题。

批次来源：搞清楚“差异”到底从哪来

首先得明白一个事实：
Visium 实验不是流水线，每一批次的处理条件都有可能不一致。
这些不一致，就是我们常说的 批次效应。

我见过一个案例，同一个样本在不同周的两次实验中，
仅仅是透化时间差了 30 秒，下游的基因检测结果就天差地别。
所以，批次来源通常包括以下几种：

• 实验日期：不同的日期，试剂批号、操作人员、环境温度都可能不同。
• 试剂批号：尤其是透化酶和捕获探针，不同批号的活性差异不容忽视。
• 操作人员：手法的差异很微妙，但确实存在。我自己就发现过，同一个 protocols，不同人做出来的组织形态差异很大。
• 测序批次：不同测序 lane 或 flow cell 的测序深度、质量都可能影响。

有个简单的表格可以帮大家理清思路：

来源类别	典型变量	影响程度	控制方式
实验操作	透化时间、温度	高	标准化 SOP、固定设备
试剂	捕获探针批号、酶	中	同一大份分装、记录批号
测序	Flow cell 差异、测序深度	中	合并测序、平衡深度
环境	室温、湿度	低但持续	恒温恒湿实验台

随机化策略：别让你的样本“一家人整整齐齐”

你想想看，如果我把 5 个正常样本放在第 1 批做，
5 个疾病样本放在第 2 批做。
最后分析出来的差异，到底是疾病导致的，还是批次差异导致的？

这就是混杂。
随机化就是为了打破这种结构。

随机化策略的核心：

• 样本随机分配：不要按组别（实验组 vs 对照组）分批次。把所有的样本混在一起，随机分配到各个实验批次中。
• 位置随机化：在同一张玻片或同一个测序 run 里，随机放置不同组的组织切片。
• 人为平衡：当样本数量很少时（比如只有 6 个），纯粹的随机可能让 3 个疾病样本全落在同一个批次。这时候需要人为干预，确保每个批次里实验组和对照组的比例大致相同。

实际执行的代码示例，我会用一个简单的随机化脚本：

import random
import pandas as pd

# 样本列表：前5个是疾病组，后5个是对照组
samples = ['Disease_1', 'Disease_2', 'Disease_3', 'Disease_4', 'Disease_5',
           'Control_1', 'Control_2', 'Control_3', 'Control_4', 'Control_5']

random.shuffle(samples)  # 随机打乱

n_batch = 2
batches = {i: [] for i in range(n_batch)}
for i, sample in enumerate(samples):
    batches[i % n_batch].append(sample)

print("批次1:", batches[0])
print("批次2:", batches[1])

对照设置：有了对照组，问题才能归因

这一点在单细胞领域里强调得很多，在空间转录组里也一样重要。
我建议的对照设置原则是：

• 同一组织内的对照：比如在肿瘤切片中，包含肿瘤组织和相邻的正常组织。这种对照可以消除组织获取过程带来的差异。
• 技术重复对照：同一块组织，切出相邻的两片，分别放在不同的批次中做。这能帮你衡量技术上到底引入了多大的 batch effect。
• 差异处理对照：如果研究药物处理，一定要有同时进行的 vehicle 处理组。

最后这个我特别要强调一下。
做药物处理时，不要等到所有样本处理完了再做 Vehicle 对照。
Vehicle 对照要和实验组在同一天、同一批条件下完成。

避免混淆因素：别让设计“画蛇添足”

混淆因素，就是那些既和你感兴趣的分组有关，又和批次有关的东西。
最有名的例子：年龄。如果你的实验组全是年轻小鼠，对照组全是老年小鼠，
然后你又在不同的日期处理它们……那你就没法区分衰老还是日期引起的差异了。

常见的混淆因素包括：

• 年龄/性别：实验组和对照组的年龄、性别分布要尽量一致。
• 组织处理顺序：不要把所有实验组样本都放在上午处理。上午和下午的组织状态可能有差异。
• 测序深度：不要一组样本测得多，另一组测的少。

我个人习惯是，在实验设计阶段就列一个“潜在混淆因素检查清单”：

潜在因素	是否均匀分布	控制措施
处理日期	否	随机分配
组织保存时间	需检查	统一冻存方案
切片厚度	否	统一设备、统一人员
RNA 完整性	需检查	RIN 值匹配

嗯，到这里实验设计的核心原则就都梳理完了。
你要是能把这四点记在心里，后面的批次校正步骤就能轻松很多。