4. 创建Seurat对象：Read10X与CreateSeuratObject

拿到单细胞测序原始数据后，第一件事就是把它读进R环境，构造成一个Seurat对象。这一步看似简单，但参数选不对，后面全白费。我刚开始接触时，就吃过文件路径不对的亏，折腾了半天才发现是目录少了一层。

说白了，创建Seurat对象就是两个核心函数的事：Read10X和CreateSeuratObject。先读数据，再装对象。嗯，我们先看看这两个函数怎么配合。

4.1 10X标准输出：三个文件一台戏

10X Genomics的cellranger跑完后，会生成一个目录，里面有三个文件缺一不可：

barcodes.tsv.gz       # 细胞条形码列表
features.tsv.gz       # 基因特征列表（基因名、ID等）
matrix.mtx.gz         # 稀疏矩阵：细胞×基因的表达量

你想想看，这三兄弟各司其职。barcodes决定细胞个数，features决定基因数量，matrix则告诉每个基因在每个细胞里有多少UMI计数。三者严格按行列对齐，少一个、错一行都不行。

我在一个项目中遇到过这样的情况：features.tsv里第一列是Ensemble ID，第二列是基因名，但后续分析需要的是基因名。如果你直接拿默认的读法，后面注释会乱套。所以，参数灵活性很重要。

4.2 Read10X：把三兄弟变成稀疏矩阵

Read10X的作用，就是把上面那三个.gz文件读成一个稀疏矩阵。为什么是稀疏矩阵？因为单细胞数据太稀疏了，一个细胞可能只表达几千个基因，大部分是0。用稀疏矩阵存储，能省几十倍内存。

来看个标准用法：

library(Seurat)

# 读取过滤后的feature-barcode矩阵
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
# 结果是个dgCMatrix（稀疏矩阵）

这里data.dir指向的就是包含那三个文件的目录。Read10X会自动识别并解析。

那么，如果cellranger输出的是原始（raw）特征矩阵而不是过滤后的怎么办？很简单，Read10X也能读，只不过原始矩阵里包含很多空液滴，需要后面过滤。我课上一般建议大家用filtered_feature_bc_matrix，因为细胞已经初步清洗过，数据量更小。

4.3 CreateSeuratObject：从矩阵到对象

矩阵读进来了，接下来就是把它变成Seurat对象。这就是CreateSeuratObject的活。别看它叫“创建”，其实它干了不少事：把矩阵存进去，顺便帮你做第一波过滤。

pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts = pbmc.data,              # 稀疏矩阵
  project = "PBMC",                # 项目名称，不重要
  min.cells = 3,                   # 基因至少在3个细胞中表达
  min.features = 200               # 细胞至少表达200个基因
)

这里面的参数，每个都有讲究。

• counts：必须是原始UMI计数的稀疏矩阵。别传归一化后的数据，否则后续标准流程会崩。
• project：就是个标签，方便识别。没啥技术影响。
• min.cells：只保留在至少N个细胞中表达的基因。默认是3。这个值太小会保留很多噪声基因，太大又会把稀有群体的标志基因误删。我一般在3~5之间调。
• min.features：只保留至少表达N个基因的细胞。默认是200。这个值用来去掉空液滴和死细胞。如果设得太低，会把死细胞混进来；设得太高，可能会把真实的小细胞丢掉。

来看一个更完整的实战流程：

library(Seurat)
library(dplyr)

# 第一步：读取数据
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")

# 第二步：创建对象，顺便过滤
pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts  = pbmc.data,
  project = "PBMC_4k",
  min.cells = 5,
  min.features = 200
)

# 第三步：检查对象
pbmc
# 会显示：An object of class Seurat with ... features across ... samples

创建完对象后，我习惯马上跑一个VlnPlot看基因数、UMI数和线粒体比例，来验证刚才的过滤阈值是否合理。但那是下一节的内容了。

4.4 整个流程直观理解

我画了一张图，帮你把从原始文件到Seurat对象的路径串起来。你看一眼就明白了。

4.5 常见踩坑与个人避坑技巧

这部分是我最想分享的。别看代码就两行，实际中问题五花八门。

• 路径错乱：data.dir要指向包含三个.gz文件的目录，不是上一级，也不是子目录。若不放心，用list.files(data.dir)先看一眼。
• 内存不足：如果用Read10X_h5读到一半崩了，试试用h5read分块读，或者换服务器。我曾在笔记本上直接跑10万细胞的数据，结果R被kill了。后来改用H5文件加DelayedArray才搞定。
• 基因名重复：features.tsv里如果有多组学数据，基因名可能会重复。Seurat会自动用make.unique处理，但最好提前检查：table(duplicated(rownames(pbmc.data)))。
• min.features设得太高：这个上面提过。建议先用一个宽阈值创建一个粗糙对象，画VlnPlot看分布，再回来改参数重建。