原始数据质控：FastQC、MultiQC

说实话，做变异检测这么多年，我见过最离谱的坑，有一半都出在原始数据上。

有一回我帮同事排查一个SNP假阳性率爆表的问题，折腾了两天，最后发现是测序接头没去干净。你想想看，后面所有GATK流程都在基于一堆污染序列做分析，结果能对吗？

所以我的习惯是——**任何数据进了我手里，第一件事就是跑FastQC**。不是走个过场，而是认真看每个指标。

为什么第一步必须是原始数据质控？

GATK推荐的Best Practices里，质控不是可选步骤。

原始数据质量直接决定了后面比对、标记重复、变异检测的准确性。如果FastQ本身就有问题，后面做再多精细调整也没用。

• 接头污染：未去除的接头序列会导致比对到错误位置，产生假阳性变异。
• 低质量碱基：质量值Q20以下的碱基，测序错误概率已经超过1%，进GATK的VQSR或硬过滤时很难挽救。
• GC含量异常：可能提示文库扩增偏好或污染。
• 序列重复率过高：PCR duplicate会使深度虚高，影响AF估计。

我个人会维护一个“质控清单”，每批数据来了先扫一遍，不合格的直接打回去重测或重新预处理。

FastQC 的基础用法

FastQC这工具，第一次用会觉得简单到不行——就一行命令。

fastqc sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz -o output_dir/

但它给出的那个HTML报告，信息量真不小。我一向要求学员至少看懂那11个模块里的前6个。

常用选项我一般加这些：

fastqc -t 8 -o qc_report/ --nogroup *.fastq.gz

• -t：线程数，我习惯设到和CPU核数一样，跑得快。
• -nogroup：不自动合并碱基位置，保留每个位置的真实质量，对看单碱基质量很有用。
• --extract：如果需要单独解析每个样本的zip文件可以加，但我更常用MultiQC汇总。

如何读懂FastQC报告里的关键指标？

很多人打开报告，看到一堆绿勾就以为万事大吉了。嗯，这里要注意——绿勾只代表“在FastQC默认阈值之内”，不代表这个指标真的没问题。

我重点看这几个模块：

模块	判断标准（我个人经验值）	常见问题
Per base sequence quality	Q30比例 >80%，读长末端质量允许下降（但不应低于Q20）	整条Read质量都低→可能测序失败；只有末端下降明显→正常，但可考虑trim
Per sequence quality scores	峰值在Q30以上，无长尾低质量分布	出现双峰→可能混入不同批次数据
Adapter Content	不应出现明显接头序列富集	超过0.1%就需要注意，超过5%必须去除
GC content	实测分布应与理论分布（物种特性）接近	尖峰且偏离理论曲线→可能污染或文库偏倚
Sequence Duplication Levels	非扩增文库（如WGS）重复率应 <20%	高重复→PCR duplicate多，可能降低有效深度
Overrepresented sequences	不应有>1%的某个未知序列	可能来自接头、rRNA残留或微生物污染

记得有一次，一个项目的WES数据QC全绿，但我一查Overrepresented sequences，发现居然有0.3%的E.coli序列。后来追查发现是样本采集时环境微生物污染。这个在后续变异检测里会产生大量同源假阳性，还好及早发现了。

多样本批量质控：用MultiQC一页看完

当你有几十甚至上百个样本时，一个个打开FastQC的HTML报告，想想就头大。

MultiQC就是为这个场景生的。它能自动扫描指定目录下所有FastQC报告，把同类指标合并到一张图上，用颜色区分好坏。一眼就能看出哪个样本有问题。

安装很简单：

pip install multiqc

使用更简单：

multiqc qc_report/ -o multiqc_result/

它会生成一个multiqc_report.html。我建议重点关注这几个图：

• FastQC: Per Sequence Quality Scores（概览图）——如果某个样本的曲线整体偏低，标红。
• FastQC: Adapter Content（热图）——一眼看出哪些样本接头超标。
• FastQC: Sequence Duplication Levels（条形图）——高重复率的样本标出来。
• General Statistics Table——所有样本的%GC、总reads数、Q30比例汇总到一起，方便排序筛选。

我习惯是：先看MultiQC的汇总表，找出那些偏离平均值的样本，然后再单独打开它们的FastQC报告细看。

实战经验：质控决策树

下面这张图是我自己总结的质控判断流程，每次跑完QC我都照着走一遍。

常见问题与解决方案

这里我把平时遇到最多的QC问题整理一下：

FastQC模块中的异常	可能原因	我常用的处理方法
Per base quality 全段都很低	测序仪器故障或试剂问题	建议重测序，不能继续使用
Adapter Content >5%	未做接头去除或去除不彻底	使用cutadapt或Trimmomatic重新处理
GC content 出现双峰	污染（例如微生物混入）	blast比对Overrepresented sequences，判断污染源
Sequence Duplication Levels >50%	PCR duplicate过多（常见于WES文库）	虽然WES允许较高重复率，但再高就需要考虑是否library准备有问题
Per base N content 后端突然升高	读长末端碱基无法判读	可以trim掉末端N较多的区域

给我的推荐流程

现在你拿到一批FastQ数据，可以这样做：

1. 对每个样本跑FastQC
2. 用MultiQC汇总所有结果
3. 检查MultiQC总表和关键模块
4. 对异常样本单独打开FastQC报告细看
5. 根据上文的决策树决定是否继续或预处理
6. 将通过质控的数据列表写进一个sample_good.txt，供下游脚本循环用

这一步做扎实了，后面比对、BQSR、变异检测才能安心。