2 测序数据格式精讲：FASTQ、BAM、VCF/BCF
做GATK质控，说白了就是跟三种文件打交道：FASTQ、BAM、VCF。你想想看，从原始下机数据到最终变异结果，每一步都存在这些文件里。我刚开始接触这行的时候，也整天被这些格式搞晕。今天我就带你把它们掰开揉碎，看看里面到底装了啥。
2.1 FASTQ：最原始的“生数据”
FASTQ文件，可以看作测序仪吐出来的“毛坯房”。它里面存的是每一条读段（read）的碱基序列，以及对应的质量值。GATK的质控，就是从检查这些原始数据开始的。
2.1.1 文件结构：四行一个记录
每个FASTQ记录是固定的四行结构，我习惯叫它“四行打卡”：
@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG
CTCAAGGTTGTTGCAAGACGGGAGGTAGGTGTAGCTGGG
+
>;>=;=?==?=?=?>=>?=?=?=?=?>=>?=?=?>=>?- 第1行（@开头）：序列标识符，包含仪器ID、flowcell、lane、tile、X/Y坐标等位置信息。GATK在做标记重复（MarkDuplicates）时，就会解析这行的信息。
- 第2行：碱基序列，就是A、T、C、G的组合。
- 第3行（+开头）：分隔符，后面可以再写一遍标识符（但通常省略）。
- 第4行：质量值，用ASCII字符表示。每个字符对应第2行每个碱基的测序质量。
2.1.2 质量值的“数”与“符”
质量值核心是Phred质量分数（Q-score）。公式很简单：Q = -10 × log10(P)，P是碱基测序错误的概率。
| Q值 | 错误概率 | 碱基准确率 |
|---|---|---|
| Q10 | 1/10（10%） | 90% |
| Q20 | 1/100（1%） | 99% |
| Q30 | 1/1000（0.1%） | 99.9% |
| Q40 | 1/10000（0.01%） | 99.99% |
那ASCII字符又是怎么对应这些数字的呢？目前常用的是Sanger格式（Phred+33）。具体做法：
ASCII值 = Q值 + 33
例如：Q=30 → ASCII值=63 → 字符 '?'
Q=20 → ASCII值=53 → 字符 '5'所以，你看到FASTQ文件第4行里那些“HHHH”之类的字符，其实背后都是有数值含义的。GATK的BaseRecalibrator就是依据这些数值，来校正系统性的测序偏差。
zcat或seqtk多看几条记录，确认质量值的中位数。
2.2 BAM：比对后的“集装箱”
FASTQ好比是散装零件，BAM就是把这些零件安装到参考基因组这个“地图”上之后的集装箱文件。我个人觉得，BAM才是GATK质控的主战场。
2.2.1 从SAM到BAM
SAM（Sequence Alignment/Map）是文本格式，BAM是它的二进制压缩版。说白了，BAM就是SAM的“打包快递”，读取更快，占空间更小。GATK所有核心工具都优先读写BAM。
一个BAM文件主要分两部分：
- 头部（Header）：以@开头，记录测序样本、参考基因组、比对参数等信息。
- 比对记录（Records）：每行一条比对结果，包含11个必填字段（列），用TAB分隔。
2.2.2 核心字段解读
我挑几个GATK经常用到的字段说说：
| 字段 | 列序号 | 说明 | GATK质控作用 |
|---|---|---|---|
| QNAME | 1 | 读段名称（与FASTQ第一行@后面的内容对应） | 用于分组、去重 |
| FLAG | 2 | 比对标志位（数字），指示读段是否比对、是否配对了等等 | 过滤低质量/未比对读段 |
| MAPQ | 5 | 比对质量分数（类似Phred值，越高越可靠） | GATK推荐MAPQ≥20 |
| CIGAR | 6 | 紧凑的比对描述，记录碱基匹配、插入、删除的情况 | 区分真正变异与比对错误 |
| SEQ | 10 | 读段序列（与FASTQ中的序列一致） | 与参考基因组对比发现变异 |
| QUAL | 11 | 序列质量值（与FASTQ中的质量字符串相同） | BaseRecalibrator使用 |
samtools flags工具把FLAG值转换成文字说明，发现这个习惯帮我避了很多坑。
2.2.3 元数据查看
BAM的头部元数据里藏着很多信息，我建议你随时用samtools view -H查看：
@HD VN:1.6 SO:coordinate
@SQ SN:chr1 LN:248956422
@RG ID:sample_01 PL:ILLUMINA SM:NA12878
@PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.17- @HD：格式版本、排序方式（coordinate或queryname）
- @SQ：参考序列名称（SN）和长度（LN）
- @RG：读组信息。这里面包含样本ID（SM）、文库（LB）、平台（PL）。GATK在做标记重复和BaseRecalibrator时，必须用到读组信息。如果没有RG标签，很多GATK工具会直接报错。
- @PG：处理程序记录，记录每一步用到的工具和参数。
2.3 VCF/BCF：最终的“变异清单”
VCF（Variant Call Format）是变异检测的终极输出。说白了，它就是一份列着所有变异位点的清单。BCF是它的二进制格式，读写更快。
2.3.1 文件结构
VCF也分两部分：元数据和数据体。
元数据行（以##开头）：
##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=
##INFO=
##FORMAT=
##contig= 数据体（以#CHROM开头为列名）：
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT sample
chr1 12345 . G A 500.73 PASS DP=100 GT:DP:GQ:AD 0/1:50:99:25,25
chr1 23456 rs12345 T C 999.90 PASS DP=200 GT:DP:GQ:AD 1/1:100:99:10,902.3.2 核心字段解读
| 字段 | 说明 |
|---|---|
| CHROM & POS | 染色体及位置（1-based） |
| ID | 变异标识，通常是dbSNP编号（如rs12345） |
| REF & ALT | 参考等位基因和替代等位基因 |
| QUAL | Phred-scaled质量值，表示该变异是真实而非错误的概率 |
| FILTER | 过滤状态。PASS表示通过所有过滤器；其他值表示被特定过滤器标记为低质量 |
| INFO | 逗号分隔的字段-值对，如深度（DP）、等位基因频率（AF）等 |
| FORMAT | 每个样本的字段格式定义 |
| 样本列 | 按FORMAT定义的顺序，存放每个样本的具体信息 |
2.3.3 FORMAT字段详解
FORMAT字段里最关键的几个：
- GT（基因型）：0表示参考等位基因，1表示第一个ALT等位基因，以此类推。例如“0/1”表示杂合，“1/1”表示纯合变异。
- DP（深度）：该位点覆盖的读段总数。
- GQ（基因型质量）：Phred-scaled质量，表示该基因型判断的可信度。
- AD（等位基因深度）：支持REF和每个ALT的读段数。比如“25,25”说明REF和ALT各有25条读段支持。
2.4 三种格式的“数据流”关系
最后，我用一张SVG图来展示这三种格式在GATK质控流程中是如何串联起来的：