3、FastQC入门：安装、运行、解读基础统计图（Per base sequence quality）
FastQC 这工具，说白了就是给你的测序数据做「体检」。它不需要你写复杂的脚本，装好、跑一下、看一眼图，就知道这批数据有没有硬伤。我到项目现场最怕的不是数据难，而是组里的人拿到 FastQC 报告只看一眼末尾的「PASS」就过了。嗯，报告里那个「PASS」骗过不少人。
安装 FastQC：两条路，看你习惯哪条
我个人习惯直接装官方二进制版本，省事，不用处理依赖。你们也这么干就行。
方法一：官网下载（推荐）
# 下载最新版（以 0.12.1 为例）
wget https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.12.1.zip
# 解压
unzip fastqc_v0.12.1.zip
# 给执行权限
chmod +x FastQC/fastqc
# 顺手加到 PATH
export PATH=$PWD/FastQC:$PATHjava -version 先确认一下。
方法二：conda 安装
如果你已经在用 conda 管理环境，这条命令更干净：
conda install -c bioconda fastqc用 conda 的好处是依赖自动解决，版本也锁得住。不过我在一次客户现场发现 conda 装的版本是 0.11.9，老到连 MultiQC 都报兼容警告。所以我建议，生产环境还是用官网的。
运行 FastQC：一行命令，别多想
基本用法极其简单：
fastqc sample_R1.fastq.gz如果你有多个文件，直接写通配符：
fastqc *.fastq.gz我记得第一次跑一批肿瘤样本时，上千个 fastq.gz 文件，我就用了这条命令。结果它一个接一个老老实实地跑完了，没崩也没报错。但注意，默认只用了单线程。想快点？加个 -t：
fastqc -t 8 *.fastq.gz跑完后同目录下会生成两个文件：一个 .html 报告，一个 .zip 压缩包。.zip 是给程序用的，.html 直接浏览器打开看。
.zip。FastQC 的 MultiQC 集成也是读 zip，解压反而多了麻烦。我组里有个新人第一次跑，把 zip 全解了，目录乱得跟战场一样。
解读 Per base sequence quality：这张图你得会看
在所有模块里，Per base sequence quality 是我最常先翻的。它在报告中排第一张，也是最能反映数据整体质量波动的图。你想想看，如果这批数据连最基础的质量都不行，后面那些比对、变异检测全是白搭。
图长什么样？
简单说：
- X轴：测序读长的碱基位置（从1到读长末尾）。
- Y轴：质量分数（Phred score）。一般是 0–40。
- 箱线图：每个位置上所有 reads 的质量分布。箱体是四分位距，须线是 10% 和 90% 分位数。
- 背景色带：绿（good）、黄（reasonable）、红（poor）。
一眼扫过去，整张图应该在绿色区域。如果前半段绿、后半段开始掉到黄甚至红，那就是典型的「质量衰减」——很正常，但不是所有衰减都能接受。
怎么判断「过了没」？
FastQC 自己会标出三种状态：
| 状态 | 条件 | 我通常怎么处理 |
|---|---|---|
| PASS | 所有碱基位置的得分中位数都 >= 28 | 直接跑下游流程，不纠结 |
| WARNING | 有碱基位置的中位数介于 20–27 | 跳起来看一眼，确认是末端衰减还是整段垮塌 |
| FAIL | 任何位置的中位数 < 20 | 这批次大概率不能用了，先查原因再决定要不要切数据 |
我踩过的两个坑
坑一：只看整体曲线，不看离散度。 我在某次质控巡查中发现一张图，中位数曲线一直在绿色区域，但箱体宽度很大，下须线直接扎进红色区。这意味着有一半的 reads 质量很差，只不过被另一半好的拉高了中位数。这种数据如果直接拿去做变异检测，假阳性能让你怀疑人生。
坑二：把 2×150 的双端数据当成两个独立文库跑。 R1 和 R2 的质量曲线很可能不一样。通常 R2 质量更差。如果你只看了 R1 的图就放行，R2 可能在第三十轮以后全是噪音。我记得有个合作项目，就是 R2 末端质量掉到 12，结果我们硬跑完了 SNP calling，最后验证出来 40% 的位点是假的。嗯，从那以后我养成了习惯：R1、R2 分开看，分别过一遍图。
避坑指南：我曾经把 FAIL 看成 PASS
那是我刚入行没多久的事。FastQC 报告里 Per base sequence quality 标了 WARNING，但中位数曲线看起来还在绿区。我当时想「还行吧，WARNING 而已」。结果客户那边反馈说数据比对率只有 65%，明显不正常。我重新拉出原始图表仔细看：X 轴到了第 130 个碱基时，下四分位线直接掉到了红色区，只不过中位数还在 24 附近晃荡。那次之后，我再也不只看中位数了——箱体的下边缘才是真正的下限。
一个快速检查步骤清单
- 打开报告的
Per base sequence quality图。 - 确认 X 轴标度是否从 1 开始对应实际读长。
- 看中位数曲线：整条线是否在 Phred ≥ 28 的绿色区域？
- 看箱体宽度：特别关注下边缘（10% 分位数）。
- 看末端：后 20–30 个碱基有没有掉进红色区？
- 如果标了 WARNING 或 FAIL，暂停，不要往下走。先拿一个样本跑 cutadapt 切数据，再重新跑 FastQC 对比。