📚 课程目录第3章实验设计与样本采集

第三章：实验设计与样本采集——组织样本的获取、固定、切片与保存

空间转录组实验，说白了，最难的不是数据分析那一步，而是最开始的样本处理。我见过太多项目，花了大价钱做测序，最后发现组织形态一塌糊涂，RNA降解得不成样子，结果全都白费了。这一章咱们就聊聊，怎么把“源头”把好关。

3.1 实验设计：先别动手，想清楚再做

拿到一个发育生物学课题，你第一件事别是去订试剂。坐下来，先想清楚这几点：

生物学重复：你研究的是发育过程，个体差异大得惊人。同一个发育阶段，至少准备3个生物学重复。我一般建议准备5个，留余地给失败的情况。
样本数量预估：切片会有损耗，原位反应会失败，所以准备样本时至少要比计划多用50%，这是行业潜规则。
对照设计：野生型 vs 突变体，处理 vs 未处理。对照样本要和实验样本在同一天、同一条条件下收集。

设计要素	常见错误	我的建议
生物学重复数	只用1只动物做所有切片	至少3只，最好5只
技术重复	忽视组织内部异质性	每个样本至少取3张连续切片
固定条件	所有样本用相同固定时间	根据组织大小调整，大块组织延长固定
RNA完整性	不做RIN检测	RIN值必须大于7，最好大于8

3.2 样本获取：从胚胎到成体，各有门道

发育样本的获取，比你想象的要精细得多。不同的发育阶段，方法完全不同。

3.2.1 胚胎的收集

对于小鼠胚胎，我习惯在孕期的特定天数，比如E10.5或E14.5，通过剖腹产取出。操作要快，从断颈到组织进入固定液，最好控制在5分钟内。

# 小鼠胚胎取出后的快速处理流程
1. 断颈处死孕鼠
2. 打开腹腔，暴露子宫
3. 无菌剪下子宫角，放入预冷的PBS
4. 在解剖显微镜下剥离胚胎膜
5. 显微剪剪断脐带
6. 将完整胚胎转入4% PFA固定液

对于斑马鱼胚胎，需要在特定发育阶段（如24 hpf或72 hpf）收集。

# 斑马鱼胚胎去绒毛膜的操作
1. 收集胚胎于培养皿中
2. 加入0.5 mg/mL pronase E溶液
3. 25℃孵育5-10分钟
4. 用显微镊轻剥绒毛膜
5. 转入4% PFA于4℃固定过夜

一个小技巧：斑马鱼胚胎的绒毛膜特别韧，去掉它才能让固定液充分渗透。我试过直接固定不去膜，结果切片时芯片区域全是空的，那个教训挺深刻。

3.2.2 成体组织的解离

成体组织，比如脑、肝、肾，体积大，需要事先切割。我个人习惯先做一个预固定，让组织变硬，这样切出来的面更平整。

# 成体脑组织的解剖要点
1. 快速断头，剥离颅骨
2. 取出全脑，放入冰冷的PBS
3. 用无菌刀片沿冠状面或矢状面切块
4. 厚度控制在3-5 mm
5. 转入4% PFA，4℃固定12-24小时

注意：切块别太厚，否则固定液渗透不到中心，中心部分的RNA会降解。我见过有人拿整个小鼠大脑直接固定，结果中心部位的信号几乎为零。

3.3 固定：决定成败的核心步骤

固定做不好，后面全是白费。我见过太多人图省事，用工业酒精或者甲醛，结果呢？RNA降解得一塌糊涂。

3.3.1 固定剂的选择

空间转录组最常用的固定剂是4%多聚甲醛（PFA）。为什么用它？它交联蛋白的同时保留RNA，而且能保持组织形态完整。

固定剂	渗透速度	RNA保留效果	推荐场景
4% PFA	慢（1 mm/h）	优秀	大多数空间转录组实验
10%中性福尔马林	中等	良好	病理标本，需要长期保存
冰醋酸-乙醇	快	较差	某些免疫组化专用，不推荐空间组学
多聚甲醛-苦味酸	中等	一般	电镜固定，不适用于空间RNA检测

3.3.2 固定液的配制

自己配PFA还是直接买商品化的？我个人的习惯是：小鼠胚胎这种小样本，用商品化PFA更稳定；大块组织，自己配能控制质量。

# 4% PFA配制方法（1 L）
1. 称取40 g 多聚甲醛粉末
2. 加入800 mL 1× PBS
3. 在通风橱中加热至60℃，不停搅拌
4. 滴加1M NaOH至溶液变清
5. 用HCl调节pH至7.4
6. 用PBS定容至1 L
7. 过滤除菌，分装后-20℃保存

警告：PFA有毒，必须在通风橱中操作。我自己刚开始做的时候，在实验台上直接配，结果头晕了一下午。从此以后，PFA配制永远在通风橱里进行。

3.3.3 固定条件与时间

固定时间很重要。太短，固定不彻底，RNA会降解；太长，交联过度，RNA提取不出来。

# 不同组织的推荐固定条件
组织类型      | 固定时间       | 温度
小鼠胚胎      | 12-24小时      | 4℃
斑马鱼胚胎    | 4-8 小时       | 4℃
脑组织        | 16-20小时      | 4℃
肝/肾组织     | 12-16小时      | 4℃
肿瘤组织      | 8-12小时       | 4℃

避坑指南：我曾经固定一批小鼠胚胎，放4℃里忘了，三天后才想起来。结果切片后免疫荧光完全没信号，RNA原位杂交也是空白。那批样本花了我两周时间，最后全废了。固定时间别超过24小时，切记。

3.4 包埋与切片：手感与经验的较量

包埋和切片这一步，真的是“三分手艺、七分感觉”。我自己也是练了半年才找到感觉。

3.4.1 脱水与透明

固定后的组织不能直接切片，需要经过脱水、透明、浸蜡三步骤。

# 小鼠胚胎脱水流程（用于石蜡包埋）
1. 固定后水洗：PBS洗3次，每次5分钟
2. 梯度乙醇脱水：
   - 70%乙醇 1小时
   - 80%乙醇 1小时
   - 95%乙醇 1小时
   - 100%乙醇 1小时×2次
3. 透明：二甲苯 30分钟×2次
4. 浸蜡：60℃石蜡 1小时×3次

对于冰冻切片，过程会简化很多，不需要蜡，直接用OCT包埋。

重点提示：冰冻切片对于RNA保存更好，因为低温抑制内源RNA酶活性。我个人更推荐冰冻切片用于空间转录组。

3.4.2 石蜡切片操作要点

石蜡切片机，说白了就是一把精密的刀。刀片的角度、切片的厚度、组织的摆放方向，都会影响最终结果。

# 石蜡切片参数设置
切片厚度：5-8 μm（空间转录组通常用8 μm）
刀片角度：6-8度
水浴温度：38-42℃
展片时间：5-10秒

嗯，这里有个很容易翻车的点：刀片角度。角度太大，组织会被挤压变形；角度太小，切出来的片子会卷起来。我用Leica RM2255切片机时，习惯设成7度角，这是我试了半年才找到的“黄金角度”。

3.4.3 冰冻切片操作要点

冰冻切片，准备工作是关键。

# OCT包埋与冰冻切片步骤
1. 组织块放入OCT中，避免气泡
2. 液氮预冷异戊烷：将组织迅速浸入
3. 组织完全冻结后，转入-80℃保存
4. 冰冻切片机预冷至-20℃
5. 切片厚度8-12 μm
6. 用防卷片展平组织
7. 将切片贴在载玻片上（阳离子玻片）
8. -80℃保存，尽快进行下游实验

关于结晶：冰冻切片最怕冰晶。如果组织冷冻速度太慢，细胞内的水会形成大冰晶，把组织形态撑破。我建议用液氮预冷的异戊烷，而不是直接把组织丢液氮。

3.5 样本保存：给切片一个安稳的家

切好的片子，不能就这么放着。RNA在常温下会快速降解，必须妥善保存。

短期保存（1周内）：-80℃密封保存，加干燥剂。
长期保存（超过1个月）：我建议尽快进行下游实验，或者用RNA stabilization buffer处理。
石蜡切片：可以室温保存几年，但RNA会随着时间慢慢降解。

我的小秘密：在-80℃保存切片时，我会在盒子里放几袋silica gel干燥剂。水分是RNA降解的帮凶，保持干燥能多放好几个月。

3.6 本章知识体系框架

下面这张图,把整个样本处理的流程串起来了。从实验设计到最终切片保存，每一步都环环相扣。

总结一下：样本处理的核心就四个字——快、冷、定、匀。快速获取、低温操作、充分固定、均匀切片。这四个点做到了，你的空间转录组实验就成功了一半。