4. BLAST 软件家族：选对工具，事半功倍

做细菌基因组注释，绕不开 BLAST。但很多人一上来就用默认的 blastn，结果跑出来的结果一堆假阳性，或者根本查不到同源序列。

我刚开始做注释时也踩过这个坑。有一次项目要注释一批噬菌体基因，我直接用 blastn 去比对，结果一大半序列都匹配不上。后来才发现，这些噬菌体基因跟数据库里已知序列的核酸相似度很低，但蛋白水平高度保守。换成 blastx 之后，命中率直接翻倍。

今天我们就聊聊 BLAST 家族里最常用的四个成员。什么时候用哪个，怎么选，我会把经验都告诉你。

一个常见的误解：很多人以为 blastn 能解决所有问题。其实蛋白比对的灵敏度远高于核酸比对，尤其是在进化距离较远的时候。

4.1 为什么会有四个不同的 BLAST？

理由很简单：查询序列和数据库序列，可以是核酸，也可以是蛋白。两两组合，就有了四种可能。

你想想看，我们手里可能是一段 DNA 序列，也可能是一段氨基酸序列。数据库也一样，既有核酸库也有蛋白库。BLAST 把这四种组合都覆盖了：

工具 查询序列类型 数据库类型 核心用途
blastn 核酸 (DNA/RNA) 核酸 核酸 vs 核酸，找高度相似的同源序列
blastp 蛋白 蛋白 蛋白 vs 蛋白，找功能相似的蛋白
blastx 核酸 (翻译成蛋白) 蛋白 核酸 vs 蛋白，预测新基因、找远缘同源
tblastn 蛋白 核酸 (翻译成蛋白) 蛋白 vs 核酸，在基因组中找可能的编码区

用对了工具，结果清晰明了。用错了，轻则跑得慢，重则漏掉关键信息。

4.2 blastn：最快的核酸比对

blastn 是直接把核酸序列跟核酸数据库比对。它的特点是快，特别快。

但快到什么程度呢？我记得有一次比对一批 16S rRNA 基因序列，几万条数据，blastn 几分钟就跑完了。如果换成 blastx，同样的数据量，可能要跑一两个小时。

不过 blastn 也有局限性。它只适合找高度相似的序列，一般建议同一性（identity）在 70% 以上才可靠。低于这个阈值，结果就会充满噪音。

我个人习惯是：

  • 比对 rRNA 基因、保守的持家基因、PCR 产物鉴定 → 用 blastn
  • 比对完整的基因组、质粒、噬菌体 → 用 blastn
  • 比对新基因、未知功能的 ORF → 别用 blastn，换成 blastx 或 blastp
一个小技巧：blastn 的 -task 参数可以切换模式。默认是 megablast，适合高度相似的序列。如果序列相似度不高，试试 blastn 或 dc-megablast。

4.3 blastp：蛋白水平的直接对话

blastp 是用蛋白序列比对蛋白数据库。蛋白序列的保守性比核酸强得多，所以 blastp 能发现更深层次的同源关系。

我做功能注释时，只要手上已经有预测好的蛋白序列，第一步一定是跑 blastp。为什么呢？因为蛋白比对的 e-value 更可靠，假阳性率更低。

举个例子：两个物种的某个基因，核酸序列可能只有 50% 相似，但翻译成蛋白之后，相似度可能达到 80%。如果只用 blastn，你就永远找不到这个同源基因。

blastp 的适用场景很明确：

  • 功能已知的蛋白，找同源蛋白
  • 蛋白结构域分析
  • 进化分析，构建蛋白系统发育树
关键参数：blastp 的 -evalue 我一般设 1e-5。如果结果太少，可以放宽到 1e-3。但要注意，放宽 e-value 后，假阳性会增多，需要人工筛选。

4.4 blastx：寻找隐藏的基因

blastx 是我最喜欢的一个工具。它把核酸序列翻译成六个阅读框的蛋白序列，然后去比对蛋白数据库。

为什么需要六个阅读框？因为核酸序列有正链和反链，每一条链又有三个阅读框。我们不知道基因到底在哪个阅读框里，所以 BLAST 会全部尝试一遍。

我经常遇到这种情况：从宏基因组数据中组装出一段 contig，看起来像是基因，但 blastn 查不到任何已知序列。这时候 blastx 就派上用场了。它能发现那些核酸层面不保守、但蛋白层面保守的基因。

有一次，我注释一个未培养细菌的基因组，里面有大量推测蛋白（hypothetical protein）。跑 blastn 全都没有结果，但跑 blastx 之后，超过 60% 都能匹配到已知的蛋白功能域。

blastx 的典型场景：

  • 对新组装的基因组进行从头注释
  • 鉴定未知功能的 ORF
  • 在宏基因组数据中寻找功能基因
  • 注释病毒或噬菌体基因组
注意：blastx 比 blastn 慢很多，因为需要先把核酸翻译成蛋白，然后做蛋白比对。数据量大时，建议先用 prodigal 或 glimmer 预测 ORF，然后用 blastp，而不是直接跑 blastx。

4.5 tblastn：从蛋白出发找基因

tblastn 是 blastx 的镜像操作。你用一段已知的蛋白序列，去搜索核酸数据库。BLAST 会把核酸数据库里的每一条序列都翻译成六个阅读框，然后跟你的蛋白序列比对。

这个工具在基因组注释中特别实用。比如你知道某个蛋白家族的保守序列，想知道某个新基因组里有没有同源基因。直接用 tblastn 扫一遍基因组，比先用基因预测工具、再跑 blastp 要快得多。

tblastn 的典型用法：

  • 寻找特定蛋白家族在基因组中的分布
  • 验证基因预测的准确性
  • 在未注释的基因组中寻找同源基因
避坑指南：tblastn 的结果里，同一个位置上可能匹配到多个阅读框。一般取分数最高的那个就行。但要注意，有些假基因或 pseudogene 可能只在某个阅读框里有部分匹配。

4.6 选择原则：一张流程图解决问题

说了这么多，到底怎么选？我画了一张流程图，把决策路径整理出来了：

BLAST工具选择流程图 开始：确定查询和数据库类型 查询序列是核酸还是蛋白？ 核酸 蛋白 数据库是核酸还是蛋白？ 数据库是核酸还是蛋白？ 核酸 vs 核酸 用 blastn 核酸 vs 蛋白 用 blastx 蛋白 vs 核酸 用 tblastn 蛋白 vs 蛋白 用 blastp 特殊情况：需要更高灵敏度？ 考虑用 PSI-BLAST、DELTA-BLAST 或 PHI-BLAST 选中工具 → 设置参数 → 运行比对 → 解读结果 完成！进入下一章

跟着这张图走，基本不会选错。我自己的经验是，90% 的情况下，只需要记住两件事：

  1. 核酸序列查核酸库 → blastn（快速、简单）
  2. 其余情况 → 优先考虑蛋白比对（更敏感、更准确）

4.7 实战中的参数建议

每人都有自己的参数习惯。我整理了一份常用参数组合，供你参考：

我的常用配置 
# blastn：注释 rRNA 基因
blastn -db nt -query 16S.fasta -out result.txt -outfmt 6 -evalue 1e-10 -num_threads 8

# blastp：预测蛋白的同源搜索
blastp -db nr -query proteins.faa -out result.txt -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 8

# blastx：新基因组从头注释
blastx -db nr -query contigs.fasta -out result.txt -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 8

# tblastn：在基因组中寻找特定蛋白家族
tblastn -db genome.fasta -query protein.faa -out result.txt -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 8
  • -outfmt 6：表格格式，方便后续处理
  • -evalue：阈值，默认是 10，太宽松，建议用 1e-5
  • -num_threads：多线程，提高速度
  • -max_target_seqs：控制输出数量，默认 500，可设为 10 或 20
性能优化：数据量大时，建议先用 -max_hsps 1 减少冗余，或者用 -max_target_seqs 100 限制输出。我曾经用 50 万条序列做 blastx，不加限制跑了三天三夜。加上 -max_target_seqs 20 之后，一夜跑完。

记住，选对工具是成功的一半。下次做注释时，先停下来想一想：我的数据是什么类型的？数据库是什么类型的？想清楚再跑，别像我当初一样，傻乎乎地只用 blastn。好了，这就是 BLAST 四兄弟的完整介绍。快去试试吧。

← 上一章 📖 返回目录 下一章 →