BLAST 程序家族：五兄弟各显神通
说到 BLAST，新手最容易蒙的就是这五个程序到底该用哪个。我刚开始做序列比对时，也经常对着参数列表发呆——blastn、blastp、blastx、tblastn、tblastx，名字长得差不多，但处理逻辑完全不同。用错了，轻则跑不出结果，重则白白浪费几小时。
说白了，这五个程序的核心区别就两个变量：你的查询序列是什么类型（核酸还是蛋白），你要搜索的数据库是什么类型（核酸还是蛋白）。排列组合一下，正好覆盖所有场景。我画了张图帮你理清关系：
blastn：核酸找核酸，最常用的老大哥
blastn 的输入是核酸序列，搜索的目标也是核酸数据库。这活儿干得最直接——不需要翻译，直接比对碱基。如果你的问题是“这段 DNA 在基因组里有没有相似片段”，那就选它。
我遇到过一些新手把 cDNA 序列直接用 blastx 去搜 RNA 数据库，结果一堆假阳性。其实大部分场景下 blastn 就够了，速度也快。举个例子：
blastn -query my_sequence.fasta -db nr_nt -out results.txt -evalue 1e-5注意那个 -task blastn 参数，默认就是 blastn，但你也可以选 megablast 来加速高相似度比对。我个人习惯，如果目标序列和数据库同源性>95%，直接用 megablast，省时间。
blastp：蛋白找蛋白，功能注释的主力
blastp 是蛋白序列对蛋白数据库。做功能注释时，这几乎是我的首选。为什么呢？蛋白序列的保守性比核酸强，跨物种比对时信号更清晰。
有一次我在一个细菌基因组里预测到一个未知 ORF，用 blastp 跑 NR 库，结果 top hit 是人类的一个激酶——E-value 1e-30。这才意识到可能是个水平转移事件。
blastp -query protein.fasta -db nr -outfmt 6 -evalue 1e-10输出格式 -outfmt 6 是制表符分割，方便后续脚本处理。我看很多教程喜欢列 -outfmt 7 带注释，但我觉得机器解析还是 6 好。
blastx：核酸翻译后找蛋白，跨界的利器
blastx 把查询的核酸序列在六个阅读框翻译成蛋白，然后跟蛋白数据库比对。这个程序特别适合分析 EST、RNA-seq 的 contig，或者那些你怀疑有编码潜力的新序列。
我曾用 blastx 处理一批 coral 的转录组数据，因为珊瑚的基因组还没组装好，但蛋白库里有近缘种。blastx 帮我找到了很多保守的功能域。
tblastn：蛋白找核酸库，反向搜索
tblastn 把蛋白序列作为查询，去搜索核酸数据库——但数据库会被动态翻译成蛋白。这听起来有点绕，但应用场景很明确：你想知道某蛋白在未注释的基因组里有没有同源片段。
比如我用一个已知的激酶蛋白去搜一个刚测序的昆虫基因组（还没做基因预测），tblastn 就能定位到可能的编码区域。我记得有一次，tblastn 的结果帮我发现了一个基因的第二个外显子，而之前的注释全漏了。
tblastn -query kinase.fasta -db insect_genome.fna -evalue 1e-5 -seg yes -soft_masking true-seg yes 和 -soft_masking true 可以过滤低复杂度区域，避免假阳性。嗯，这里容易踩坑。
tblastx：核酸翻译后互相找，最慢但最全
tblastx 是“双重翻译”——查询和数据库都从核酸翻译成蛋白，再比对。这基本是最后的手段了，因为它比 blastx 还慢一个数量级。但当你手头只有 EST 或 cDNA 数据，又想检测远缘同源时，tblastx 往往能挖到别人找不到的线索。
坦白讲，我用了十年 BLAST，实际生产中 tblastx 的使用比例不到 2%。大部分场景可以用 blastx 或 tblastn 替代。只有在跨门级比较、且数据库也是核酸库时，才会祭出这个慢家伙。
一表打尽：五大程序对比
| 程序 | 查询类型 | 数据库类型 | 是否翻译 | 速度 | 典型场景 |
|---|---|---|---|---|---|
| blastn | 核酸 | 核酸库 | 否 | 最快 | DNA同源搜索、基因组比对 |
| blastp | 蛋白 | 蛋白库 | 否 | 快 | 蛋白功能注释、结构域识别 |
| blastx | 核酸 | 蛋白库 | 查询翻译 | 中等 | 新序列功能预测、转录组注释 |
| tblastn | 蛋白 | 核酸库 | 数据库翻译 | 中等 | 未注释基因组中找同源蛋白 |
| tblastx | 核酸 | 核酸库 | 双方翻译 | 最慢 | 远缘同源检测、EST跨物种比对 |
怎么选？记住这个口诀
说一千道一万，最终归结为一个问题：你的查询和数据库各自是核酸还是蛋白？对照下面的清单，一分钟就能定下来：
- 核酸查核酸库 → blastn 或 megablast
- 蛋白查蛋白库 → blastp
- 核酸查蛋白库 → blastx
- 蛋白查核酸库 → tblastn
- 核酸查核酸库（但想看蛋白级保守性） → tblastx
我曾经犯过一个低级错误：拿着一段 cDNA 跑去用 blastn 搜蛋白库，结果空跑半小时。后来才反应过来——blastn 根本不接受蛋白数据库，如果混了会报错。再后来我写了个小脚本，自动检测输入文件是核酸还是蛋白，然后再匹配正确的程序。你想想看，如果每次都要手动判断，时间久了肯定出错。
-query_gencode 指定翻译密码表。比如线粒体编码用 2 号密码表。这个参数在 blastx 和 tblastn 里非常实用，尤其是分析线粒体或叶绿体数据时。我有个项目就栽在这个上面，默认用标准密码表翻译，结果多肽链提前终止，后来改过来才对了。
好了，五种程序的脾性你应该心里有数了。后面每个程序的具体参数调优，我们会在不同章节拆开细讲。今天就先到这儿——记住那张图和表格，下次面对 BLAST 不会选错。