第四讲：BLAST 数据库介绍与构建（NCBI nt/nr 等）
为什么要搞明白数据库？
做 BLAST 本质上就一句话：拿你的序列去跟一个已知的数据库比对。说白了，数据库就是你的「参考字典」。字典好不好，直接决定你比对出来的结果有没有价值。我刚入行那会儿，觉得 BLAST 数据库就是个索引文件，随便下个 nt 就能用。结果项目跑了两天，发现数据库版本错了，整批分析结果全废……嗯，从那以后，我每次构建数据库前都会先做三件事：确认版本、校验完整性、检查索引状态。
NCBI 提供两类核心数据库：nt 和 nr。你想想看，nt 是所有核酸序列的集合，nr 是非冗余蛋白库。它们的目标完全不同，使用场景也各有讲究。下面我把常见的几类数据库列出来，方便你做选择。
| 数据库名称 | 全称 | 数据内容 | 常用场景 |
|---|---|---|---|
| nt | Nucleotide collection | GenBank/EMBL/DDBJ 所有核酸序列（含冗余） | 核酸比对、物种鉴定、引物设计验证 |
| nr | Non-redundant protein | 非冗余蛋白序列（去冗余后） | 蛋白功能注释、同源搜索、结构域识别 |
| refseq_rna | RefSeq RNA | RefSeq 精选 RNA 序列（高置信度） | 转录组注释、基因结构验证 |
| refseq_protein | RefSeq Protein | RefSeq 精选蛋白序列 | 高质量蛋白功能预测 |
| swissprot | UniProt Swiss-Prot | 人工校验的蛋白序列 | 高置信度功能注释 |
数据库构建：从下载到索引
你从 NCBI 下载的是 FASTA 文件，BLAST 不能直接用它搜索。你需要先通过 `makeblastdb` 构建成二进制索引。为什么？我举个例子：文本文件里找一条序列要逐行扫描，索引文件则像字典的拼音目录，直接定位到目标位置。
下面是下载和构建 nr 数据库的完整流程。注意：nr 今天已经超过 100 GB，网速慢的话别全量下载。我建议先用 `update_blastdb.pl` 脚本增量更新，或者只下你需要的子集。
1. 使用 update_blastdb.pl 自动下载
# 下载 nt 数据库（核酸）
perl update_blastdb.pl --decompress nt
# 下载 nr 数据库（蛋白）
perl update_blastdb.pl --decompress nr
# 只下载特定部分（比如只下载环境样本库）
perl update_blastdb.pl --decompress env_nt这个脚本会自动解压 `.tar.gz` 文件，最终得到 `nr.00.tar.gz`、`nr.01.tar.gz` …… 以及里面的 FASTA 文件和索引文件。它还会自动跳过已下载且完整的文件，你只管跑就行。
2. 手动构建索引
如果因为网络限制，你只能拿到 FASTA 文件（比如从第三方镜本站下载），那就需要手动构建。
# 核酸库索引
makeblastdb -in nt.fa -dbtype nucl -out nt_db
# 蛋白库索引
makeblastdb -in nr.fa -dbtype prot -out nr_db
# 给索引添加标题（方便后续识别）
makeblastdb -in my_genome.fa -dbtype nucl -title "MyGenome v1.0" -out my_genome参数说明：
-dbtype：必须跟原始序列类型一致，核酸选 nucl，蛋白选 prot。搞反了会报错 "BLAST engine error"。-out：输出前缀，后续 BLAST 命令的-db参数就填这个前缀。-title：非必须，但建议加上，尤其在管理多个版本时。
3. 索引文件结构
构建成功后你会看到一堆同名前缀的文件，比如 nr_db.phr、nr_db.pin、nr_db.psq…… 它们各自存了不同的索引信息：
| 后缀 | 内容 |
|---|---|
| .pbd / .nbd | BLAST 数据库头文件（版本、统计信息） |
| .phr / .nhr | 序列头部信息（ID、描述行） |
| .pin / .nin | 序列编号到位置映射 |
| .psq / .nsq | 序列数据本身（二进制压缩） |
你自己不需要手动改这些文件。它们全是二进制格式，BLAST 程序运行时自动加载。
SVG：数据库构建与比对流程
自定义数据库：构建自己的专属库
除了 NCBI 的公共库，你完全可以把自己的序列做成 BLAST 数据库。比如我手头有一个新测序的菌株，要跟已有的 20 个菌株比较，那就把它们的 CDS 或蛋白序列抽出来，做成一个私有库。
构建自定义库的步骤
- 将所有目标 FASTA 合并成一个文件（注意序列 ID 不能重复，否则会报 warning）。
- 运行
makeblastdb，指定-dbtype和-out。 - 用
blastdbcmd验证索引是否正常：blastdbcmd -db my_db -info
# 示例：构建一个自定义核酸库
cat genome1.fna genome2.fna > combined_cdna.fa
makeblastdb -in combined_cdna.fa -dbtype nucl -title "TwoGenomes_CDNA" -out two_genomes
# 验证
blastdbcmd -db two_genomes -info输出类似这样：
Database: TwoGenomes_CDNA
Number of sequences: 8572
Number of letters: 12,345,678
Number of letters in sequence data tree: 0
Number of letters remaining after clustering: 0
Total number of ambiguities residues: 0
Number of isoelectric points: 0
Number of molecular weights: 0
Number of sequences with undefined pI/MW: 8572
Date: 2025-03-15看到 "Number of sequences: 8572" 就说明索引建好了。如果数字明显不对，可能是合并时漏了或者有空的序列头。
常用数据库维护命令
我整理了几条日常用得最多的命令，你们可以收藏起来：
| 操作 | 命令 |
|---|---|
| 查看数据库统计信息 | blastdbcmd -db my_db -info |
| 列出数据库中所有序列 ID | blastdbcmd -db my_db -entry all -outfmt %i |
| 提取指定序列（按 ID） | blastdbcmd -db my_db -entry GI:12345 -out seq.fa |
| 检查数据库是否完整 | blastdb_aliastool -db my_db -check |
| 删除旧数据库 | 直接删除所有同前缀文件即可：rm my_db.* |
blastdbcmd -entry all -outfmt %i 快速提取所有序列 ID，再跟我的目标列表取交集，省掉自己写脚本解析 FASTA 头。
数据库选择策略总结
说到这，你可能会问：到底该用哪个库？我分享一个简单的决策树：
- 快速筛选物种：用 nt，跑 blastn。因为核酸比对可以直接定种。
- 功能注释：用 nr 跑 blastp（蛋白 vs 蛋白），同时打开
-evalue 1e-5，覆盖度要超过 70%。 - 高置信度注释：用 Swiss-Prot 跑 blastp，结果几乎不用再过滤。
- 跨物种比较：用 refseq 或 nr，别用 nt（不同物种的核酸差异太大）。
- RNA 注释：优先用 refseq_rna，或者用 nt + 加
-task blastn-short（短序列模式）。
好了，数据库这部分算是讲透了。你要做的是动手跑一次：下载 nt 的一个子集（比如只下载 env_nt 或 refseq_rna），构建索引，然后用 blastdbcmd 看看里面有什么。亲自走一遍流程，比看十遍文档都管用。