第3章 实验设计要点：从细胞培养到上机的全套前处理流程
这一章我们聊聊前处理。我个人经验，前处理这块至少决定了整个实验 50% 的成败。你质谱再牛，样本没处理好，出来的数据就是一坨浆糊。细胞级定量分析，要求更高，因为起始量就那么点，每个步骤都得精打细算。
3.1 细胞培养：把好第一道关
很多人觉得培养细胞没啥好说的。其实这里头坑不少。
先说说培养基的选择。注意了，这里有个关键点——血清。我建议你用透析处理过的血清，或者直接用无血清培养基。为什么？普通血清里有大量牛源蛋白和肽段，这些会严重干扰后续的定量结果。你想想看，信号乱入，最后算出来的丰度你敢信吗？
细胞数量这块，我直接给标准：
| 分析类型 | 推荐起始细胞数 | 说明 |
|---|---|---|
| 单次LC-MS/MS（常规） | 1×10⁶ ~ 5×10⁶ | 适合全细胞裂解 |
| 磷酸化富集分析 | 1×10⁷ ~ 2×10⁷ | 信号稀释，需要量更大 |
| 单细胞级别（特殊方案） | 100 ~ 1000 | 需升级配套设备 |
我个人习惯，在正式实验前先做一次预实验。取 1×10⁶ 个细胞跑一次流程，检查蛋白提取效率和酶解是否彻底。这一步花不了多少功夫，但能帮你提前发现大问题。
3.2 裂解：把蛋白“请”出来
裂解这一步，说白了就是破坏细胞膜和核膜，让蛋白释放到溶液里。但要注意，你不能把蛋白“撕碎”了，得保证它们完整。
我推荐的标准裂解液配方：
8 M 尿素
100 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1× 蛋白酶抑制剂混合物
(可选) 磷酸酶抑制剂 — 做磷酸化分析时必须加为什么要用 8 M 尿素？高浓度尿素能让蛋白充分变性，打开高级结构，让后续的酶切位点完全暴露。但你浓度不能降，低了效果不好；也不能加太多，否则后续除盐压力大。
裂解方式我比较两种：
- 超声裂解：效率高，适合大量样本。参数我一般设振幅 30%，超声 3 秒，停 5 秒，总时间 3 分钟。注意整个过程要在冰上进行，防止超声产热使蛋白降解。
- 高压破碎（French Press）：更温和，适合需要保持蛋白复合物结构的场景。不过设备贵，通量低。
说句大实话，裂解最怕什么？泡沫。你超声时间控制不好，或者涡旋振荡太猛，溶液起泡了，蛋白就容易被氧化。我曾经见过有人把样本振荡出半管泡沫，结果定量结果全漂了。
3.3 还原与烷基化：打断二硫键
这一步的目的是把蛋白中的二硫键打断，再把游离的巯基保护起来。不这么做，酶切的时候会有空间位阻，位点覆盖不全。
标准流程如下：
- 加入 DTT 至终浓度 5 mM，56°C 孵育 30 分钟。
- 冷却至室温，加入 IAM 至终浓度 15 mM，避光孵育 30 分钟。
- 最后加入 DTT 至终浓度 5 mM，中和多余的 IAM。
3.4 酶解：Trypsin 是主角
酶解是整个前处理的核心环节。酶切不彻底，你就别想拿到高质量图谱。
我个人用得最顺手的组合是 Trypsin + LysC 双酶切。为什么？Trypsin 切 K 和 R 的 C 端，LysC 只切 K 的 C 端。两个酶一配合，肽段长度更均匀，鉴定率更高。
具体参数：
酶与底物比例： 1:50 (w/w)
酶解时间： 16-18 小时（过夜）
温度： 37°C
缓冲液： 100 mM Tris-HCl，pH 8.0| 酶种类 | 切割位点 | 推荐使用场景 |
|---|---|---|
| Trypsin | K, R 的 C 端 | 标准蛋白组学 |
| LysC | K 的 C 端 | 与 Trypsin 联合使用 |
| GluC | E, D 的 C 端 | 特殊修饰分析 |
你看这个表格，不同酶有不同专一性。如果你只做常规定量，Trypsin 足够了。但如果你要追求最高的序列覆盖率，我强烈建议加上 LysC。
这里有一个容易犯的错误——酶解时间不够。有人为了赶进度，只酶解 4 小时就收了。结果呢？肽段都是大片段，质谱里信号很差。我的习惯是：晚上加酶，第二天早上收样。16 小时，稳稳的。
3.5 除盐：把干扰物清干净
酶解之后，溶液里有尿素、盐、酶碎片，这些玩意进了质谱就是灾难。你需要用 C18 柱或者 stage tip 做一步除盐。
标准除盐步骤：
- 活化：用 100% 乙腈冲洗 C18 柱。
- 平衡：用 0.1% TFA（三氟乙酸）水溶液过柱。
- 上样：样本用 0.1% TFA 稀释后，缓慢过柱。
- 洗涤：用 0.1% TFA + 5% 乙腈水溶液洗脱杂质。
- 洗脱：用 0.1% TFA + 80% 乙腈水溶液将肽段洗下来。
# 除盐流程小抄
活化： 200 µL 100% ACN
平衡： 200 µL 0.1% TFA
上样： 样本 + 0.1% TFA 至总体积 ~200 µL
洗涤： 200 µL 0.1% TFA + 5% ACN
洗脱： 150 µL 0.1% TFA + 80% ACN除盐完成后，把样本在真空浓缩仪里干燥，或者直接冻干。干燥后的肽段在 -80°C 可以保存至少一个月。
3.6 上机：最后的准备
上机前，用 0.1% 甲酸水溶液把肽段复溶。我这里给一个经验公式：
每 1 µg 蛋白提取物，用 10 µL 复溶液。这样上机进样 2 µL，差不多就是 200 ng。这个量在常规 LC-MS/MS 上，信号强度刚刚好，不饱和也不低。
- 样本有没有沉淀？有的话离心取上清。
- 复溶液有没有气泡？气体进质谱会打火。
- 进样瓶盖子拧紧了没有？挥发掉样本就白干了。
说到上机，我建议一次实验至少做三个技术重复。如果样本量允许，再做一个生物重复。数据量越多，统计显著性越好。
3.7 全流程框架图
下面这张图总结了本章讲的所有步骤。你可以把它打印出来贴实验台旁边，做实验时对着一目了然。
从细胞培养到上机，一共 7 个核心步骤。每一步都环环相扣。你前面做得好，后面的数据就漂亮。反之，任何一步出了岔子，重做一整轮实验都是常有的事。
别急，慢慢来。前处理这件事，讲究的就是一个“稳”字。时间给够，条件控好，数据自然会回报你。