📚 课程目录第4章数据标准化方法

4. 数据标准化方法：相对丰度、CSS、TMM、RLE详解

拿到测序数据后，很多人上来就做差异分析。但你知道吗？不同样本的测序深度、文库大小、甚至批次效应都会让原始计数没法直接比较。我记得刚开始做宏基因组项目时，没做标准化就直接跑热图，结果全是假差异——那次教训挺深刻的。

标准化说白了就是给每个样本的计数“找个公平的基准”。不同方法思路不一样，适用场景也不同。下面我带你逐个捋一遍。

核心观点：没有万能的标准化方法。选择取决于你的数据特性和分析目标。

4.1 相对丰度（Relative Abundance）

这是最直观的方法——把每个物种的计数除以该样本的总计数，再乘以100%，得到百分比。用R实现极其简单：

# 假设 counts 是矩阵，行是物种，列是样本
rel_abund <- sweep(counts, 2, colSums(counts), "/") * 100

为什么很多人爱用它？因为解释起来方便：这个菌占了多少比例。但它有个硬伤——所有样本的总和都变成100%，丢失了绝对丰度信息。比如A样本测了100万条reads，B样本测了10万条，变成百分比后完全看不出总量差异。

我建议：只用于快速探索性分析，比如画堆叠柱状图、饼图。真正做差异检验时别用它。

优点	缺点
计算快、直观	丢失绝对丰度信息
适合可视化比例	对零值敏感，不适合稀疏数据
不受测序深度影响	假阳性率高（组成效应的根源）

避坑：我曾经用相对丰度做PCA，结果所有样本聚成一团——完全看不出来分组差异。后来换成CSS标准化才分离出生物学差异。记住：相对丰度只能看“比例”，不能用于统计建模。

4.2 CSS（Cumulative Sum Scaling，累积和缩放）

CSS是metagenomeSeq包的拿手好戏。它的思路挺聪明：找所有样本中计数的“分位数”作为缩放因子，而不是用总计数。具体来说，它会计算每个样本的累积和曲线，找到那个“不再受零膨胀干扰”的点（通常是第50个百分位数），然后用这个点去缩放。

# 使用 metagenomeSeq 包
library(metagenomeSeq)
obj <- newMRexperiment(counts)
obj <- cumNorm(obj, p = cumNormStat(obj))
css_norm <- cumNormMat(obj)

# 或者用 phyloseq 的 wrapper
# 需要先安装，然后直接调 normalize() 函数

CSS的好处是：对稀疏矩阵（很多零）很稳健。因为零值不会干扰分位数估计。但它只适合比较样本间的相对丰度变化，不适合定量绝对丰度。我一般用它做有监督的差异丰度分析（比如metagenomeSeq的零膨胀高斯混合模型）。

参数	说明
p（分位数）	默认0.5，但可以用`cumNormStat()`自动估计
缩放因子	每个样本的累积和截止点
适用场景	稀疏矩阵、有大量零值的宏基因组数据

经验：CSS对低深度样本不太友好。如果某个样本总reads不到10万，它的分位数估计会很不稳定。建议先过滤低丰度OTU（平均丰度<10），再做CSS。

4.3 TMM（Trimmed Mean of M-values）

TMM来自edgeR包，最初是为RNA-seq设计的，但宏基因组数据也常用。它的核心是：找两个样本间表达量变化最稳定的那些基因（或OTU）来估计缩放因子。

具体来说，它会剔除上下30%的极端M值（log倍变化），然后用剩下的基因计算加权平均。这样做的好处是，那些差异很大的高丰度物种不会扭曲缩放因子。

library(edgeR)
dge <- DGEList(counts = counts)
dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")
norm_factors <- dge$samples$norm.factors
# 归一化后的计数可以直接用 cpm(dge, normalized.lib.sizes = TRUE) 获得
tmm_cpm <- cpm(dge, normalized.lib.sizes = TRUE)

我自己在肠道菌群项目中用过TMM，效果不错。但要注意：TMM假设大多数物种没有差异。如果你的实验是极端对比（比如无菌vs正常），这个假设可能不成立。

特性	TMM	RLE（见下一节）
基准样本	用某个参考样本（默认第一个）	用伪参考（所有样本的中位数）
截断比例	默认上下30%	默认上下30%
适用数据类型	RNA-seq，宏基因组的相对丰度比较	与TMM类似，但更稳健

曾经踩坑：有一组样本，其中一个全是低丰度物种，TMM的缩放因子直接变成了0.2，导致那个样本所有物种计数都被放大5倍。检查发现是参考样本选得太差。解决办法：用某个高质量的样本作为参考，或者改用RLE。

4.4 RLE（Relative Log Expression）

RLE是DESeq2的默认标准化方法。它的思路更优雅：对每个物种，计算其在所有样本中的几何均值，然后每个样本的每个物种计数除以这个几何均值，再取中位数作为缩放因子。

说白了，RLE假设大多数物种的表达量在样本间是稳定的。这个假设在很多微生物组数据中成立（因为核心菌群的存在）。

# DESeq2 方法
library(DESeq2)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = counts,
                              colData = metadata,
                              design = ~ condition)
dds <- estimateSizeFactors(dds)
size_factors <- sizeFactors(dds)
rle_norm <- counts(dds, normalized = TRUE)

RLE比TMM更稳，因为它用的是中位数，而且伪参考不依赖任何特定样本。我用RLE做过几十个项目的差异分析，翻车案例极少。

方法	缩放因子计算	推荐R包	我的评分（5分满）
相对丰度	总计数	基础R	⭐
CSS	累积和分位数	metagenomeSeq	⭐⭐⭐⭐
TMM	修剪M值加权平均	edgeR	⭐⭐⭐
RLE	几何均值中位数	DESeq2	⭐⭐⭐⭐⭐

实用技巧：如果你不确定用哪种，可以先跑一遍RLE。然后检查标准化后的样本间箱线图——如果中位数都对齐了，说明成功。如果还歪，换TMM或CSS试试。

4.5 方法选择决策流程

为了让你一眼看明白，我画了张流程图。按照这个走，基本不会错。

4.6 实操中的注意事项

检查缩放因子：无论用哪种方法，先打印sizeFactors或norm.factors，看看有没有异常值（比如0.1或10+）。有的话说明该样本质量差。
标准化后做QC：用boxplot看样本间的分布是否对齐。如果中位数差异大，换方法。
不要混合使用：同一个分析里别混用TMM和RLE的缩放因子。选定一种，全程一致。
零值处理：所有基于比值的标准化方法（TMM、RLE）都会受到大量零值的影响。如果数据稀疏率超过80%，优先考虑CSS或基于模型的方法（如ZINB）。

我的默认配置：现在只要做微生物组差异分析，我第一步跑DESeq2的RLE，同时用CSS做一遍敏感性验证。如果结果一致，放心；不一致就深挖原因。这招帮我省了不少返工时间。

4.7 综合对比表

方法	核心思想	适用软件包	典型场景
相对丰度	占总计数的比例	基础R	堆叠柱状图、饼图
CSS	累积和分位数缩放	metagenomeSeq	稀疏宏基因组数据
TMM	修剪M值加权平均	edgeR	RNA-seq、细菌16S
RLE	几何均值中位数	DESeq2	默认首选，稳健