数据预处理：Seurat 流程与质量控制

说实话，我见过不少朋友一拿到 Visium 数据就急着跑聚类，结果出来的图根本没法解释。嗯，问题多半出在预处理上。预处理这一步没做好，后面选什么算法都是白搭。

我自己刚开始做空间转录组的时候，也踩过这个坑。当时的逻辑是：“反正后面有那么多聚类方法，总有一个能给我好结果吧？”结果花了三天调参数，还不如老老实实把 QC 做好。从那以后，我养成了一个习惯 —— 花 40% 的时间在预处理上。

为什么预处理这么重要？

空间转录组数据跟单细胞数据很像，但它多了一层位置信息。如果原始数据里混了太多死细胞点、线粒体比例过高的点，或者文库质量太差的点，后面的聚类算法会把这些异常点当成正常组织区域，导致边界模糊、误导生物结论。

说白了，预处理就是在“去伪存真”。只有把干净的数据交给下游算法，聚类结果才有复现性。

Seurat 标准流程概览

我习惯把 Seurat 的空间预处理分成六个核心步骤，下面这张图可以帮你快速建立整体印象：

每一步都有它的门道。下面我把每个环节单独拆开讲，顺便说一说我踩过的坑。

关键步骤详解

1. 数据读取与过滤

Visium 数据通常包含三个文件：原始计数矩阵（filtered_feature_bc_matrix.h5）、组织图像（tissue_lowres_image.png）、以及 spot 坐标（tissue_positions_list.csv）。Seurat 的 Load10X_Spatial() 可以一次性读入。

# 读入 Visium 数据
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(ggplot2)

data_dir <- "path/to/spaceranger/outs/"
sobj <- Load10X_Spatial(data.dir = data_dir,
                         filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5",
                         assay = "Spatial",
                         slice = "slice1",
                         filter.matrix = TRUE)

filter.matrix = TRUE 是默认值，会去掉空点（没有组织覆盖的 spot）。

2. 质量控制指标

我常用的 QC 指标有三个：nFeature_Spatial（每个 spot 检测到的基因数）、nCount_Spatial（总 UMI 数）、percent.mt（线粒体基因比例）。

# 计算线粒体比例
sobj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(sobj, pattern = "^MT-")

# 查看 QC 分布
VlnPlot(sobj, features = c("nFeature_Spatial", "nCount_Spatial", "percent.mt"),
        ncol = 3, pt.size = 0.01) + NoLegend()

那阈值怎么定？我个人的经验是这样的：

但别死搬硬套。我在做小鼠大脑切片时，髓鞘丰富的区域 nFeature 天生偏低，这时候如果把阈值设成 500 就会扔掉很多白质区的点。所以 先画一张 SpatialFeaturePlot 看看 bad spots 的位置，再做决定。

SpatialFeaturePlot(sobj, features = "percent.mt") + 
  scale_fill_gradientn(colors = c("gray90", "orange", "red"))

3. 过滤与归一化

# 过滤
sobj <- subset(sobj, 
               subset = nFeature_Spatial > 500 & 
                        nFeature_Spatial < 5000 & 
                        percent.mt < 20)

# 标准归一化
sobj <- NormalizeData(sobj, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

# 高变基因
sobj <- FindVariableFeatures(sobj, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

归一化方法我通常先用 LogNormalize。如果组织内有明显的批次效应或技术噪音，可以考虑 SCTransform，它用正则化负二项回归一次性完成归一化、方差稳定化、以及高变基因选择。但 SCTransform 计算量较大，我用过几次后觉得它对大样本更友好。

4. ScaleData 与 PCA

在高变基因上做 scale 和 PCA，这步没什么技术难点，但注意 scale.factor 的设定：

# 只对高变基因做缩放（加速）
sobj <- ScaleData(sobj, features = VariableFeatures(sobj))

# PCA
sobj <- RunPCA(sobj, features = VariableFeatures(sobj), npcs = 30)

PCA 之后一定要用 ElbowPlot 确定合适的主成分个数，一般取拐点前 10～20 个 PC 即可。不需要贪多，加太多噪音成分反而会干扰后续聚类。

完整的预处理封装函数

下面是我自己项目中常用的一个包裹函数，可以直接用在 Visium 对象上：

#' Spatial 数据预处理封装
#' @param sobj Seurat 对象
#' @param min_nFeature 默认 500
#' @param max_nFeature 默认 5000
#' @param max_pMT 默认 20
#' @param nfeatures_var 高变基因数 2000
#' @param npcs PCA 主成分数 30
preprocess_visium <- function(sobj,
                               min_nFeature = 500,
                               max_nFeature = 5000,
                               max_pMT = 20,
                               nfeatures_var = 2000,
                               npcs = 30) {
  
  # 计算 QC 指标
  sobj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(sobj, pattern = "^MT-")
  
  # 过滤
  sobj <- subset(sobj,
                 subset = nFeature_Spatial > min_nFeature &
                          nFeature_Spatial < max_nFeature &
                          percent.mt < max_pMT)
  
  # 归一化
  sobj <- NormalizeData(sobj, verbose = FALSE)
  
  # 高变基因
  sobj <- FindVariableFeatures(sobj, selection.method = "vst",
                                nfeatures = nfeatures_var, verbose = FALSE)
  
  # Scale + PCA
  sobj <- ScaleData(sobj, features = VariableFeatures(sobj), verbose = FALSE)
  sobj <- RunPCA(sobj, features = VariableFeatures(sobj), npcs = npcs, verbose = FALSE)
  
  return(sobj)
}

# 一行调用
sobj <- preprocess_visium(sobj)

常见坑与避坑指南

• 坑 1：过滤后剩下少于 100 个 spot。 大概率是阈值设太严。我建议先画 SpatialFeaturePlot 看看坏点的空间分布，视觉上确认后再调参。
• 坑 2：高变基因选了默认的 2000，结果 PCA 图中的分离度很差。 可以考虑增加到 3000～5000，尤其在组织异质性较高的样本（如肿瘤）。
• 坑 3：用 SCTransform 时内存爆了。 如果组织切片包含几万个 spot，建议先做 fastMNN 或者选批次平衡策略。我个人的变通做法是：先 LogNormalize 跑一遍快速调参，最后定稿时再换成 SCTransform。
• 坑 4：比例缩放后基因表达值全为 0。 检查一下之前是否过滤掉了所有高表达基因，或者 scaling 时用了全基因集而非仅高变基因。我习惯显式指定 features = VariableFeatures(sobj) 来避免这个问题。