📚 课程目录第4章数据质量控制（QC）与过滤

4. 数据质量控制 (QC) 与过滤

到了这一步，其实有个灵魂拷问摆在你面前：原始数据敢直接用吗？

我个人习惯是，先扫一眼数据质量再动手跑任何聚类。因为如果底子就是烂的，后面调出一朵花来也没用。做这个项目的时候，我一开始拿到的那套公开肿瘤数据，直接丢进去算，结果发现标记数分布和线粒体比例都很不对劲——嗯，下面会详细说这个问题。

4.1 为什么先做数据质量控制？

Visium 平台的原理其实就是原位捕获 + 测序。它是切片贴片方式，难免有些点(spot)质量不好，比如组织边缘的 spot 可能捕获细胞太少，或部分 spot 捕获了掉下来的细胞碎片。

标记数太少：统计信息弱，后续聚不了类。
UMI 重复太高：表示扩增偏差，不是真实的生物信号。
线粒体比例过高：通常是细胞受损或凋亡的标志。

在一个真实项目里，我见过一份数据，一次切片大约 3%-5% 的 spot 是碎片区。如果不过滤掉，这些“低质量邻居”会干扰降维和聚类算法，最后出来的图有奇怪的噪声簇。

⚠ 注意：过滤标准应该基于数据本身的分布来定，而不是硬套文献。前面那个项目我一开始套了别人的阈值，结果把一大半 good spot 也干掉了，后面重跑浪费了半天。

4.2 检查哪些指标？

无非三件事：总 UMI 数、检测到的基因数、线粒体百分比。你想想看，这三个指标基本覆盖了“捕获够不够”、“信噪比高不高”、“细胞是否健康”。

指标	含义	通常低质量判断
nCount_UMI	每个 spot 的总 UMI 计数	过低（< 500）或极端高异常
nFeature_RNA	每个 spot 检测到的独有基因数	过低（< 200 或 100）
percent.mt	线粒体基因 UMI 占总 UMI 比例	过高（> 20% 或 25%）

其实，我习惯在过滤前先画一个 Violin 图和 Scatter 图看一下分布。你一眼就能看出哪些是尾巴、哪些是极端值。

4.3 过滤脚本怎么写？

在 R 里，以 Seurat 为例，你可以这样做：

# 计算线粒体比例
tumor_data[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(tumor_data, pattern = "^MT-")

# 可视化
VlnPlot(tumor_data, features = c("nCount_UMI", "nFeature_RNA", "percent.mt"),
        ncol = 3, pt.size = 0.01)

# 手动过滤
tumor_data <- subset(tumor_data,
      subset = nFeature_RNA > 200 &
               percent.mt < 20 &
               nCount_UMI > 500)

嗯，这里要注意：如果你用 Python 的 Scanpy，语法略有不同，但逻辑一样。

import scanpy as sc

# 读入 h5 文件
adata = sc.read_visium("path/to/spaceranger/output")

# 计算 QC 指标
adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt"], percent_top=None, log1p=False)

# 过滤
adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts > 200, :]
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 20, :]
adata = adata[adata.obs.total_counts > 500, :]

还记得吗？我曾经过滤完忘记更新高变基因列表，结果后面 PCA 降维时总感觉不对劲。后来就养成了习惯：过滤后一定要重新跑一下找高变基因和归一化。

4.4 流程图：数据进至 QC 过滤

画个流程来总结一下这一节。

流程其实很直接，但每一步的阈值可视化不能省。为什么？因为你凭肉眼看到分布才知道哪些 spot 是离群。

4.5 避坑指南：过滤标准不要太死

我记得刚用 Visium 数据那会儿，总喜欢参考公共数据集的通用阈值。但 Visium 的捕获效率、切片厚度、组织类型不同，UMI 分布差异会很大。

组织类型敏感：比如脑组织的线粒体比例通常较高，可以适当放宽松一些到 25%。
nCount 上限也要看：过高的 nCount 可能是来自组织边缘污染的双 spot，我一般会画箱线图去掉上分位数+3 IQR 以上的点。
千万不要一开始就过滤掉低表达基因：那个可以在后面找高变基因时再做。

💡 个人经验：我那回在过滤时，保留了所有 nFeature > 200 且 mt% < 20 的 spot，画出来聚类还不错，但有一个小病理区一直出现混聚，后来发现是那批 spot 的 nCount 异常偏低，放宽了阈值后就没问题了。

4.6 检查过滤效果

过滤完了，我喜欢再做一个数据分布的总结，比如看看还剩多少个 spot，以及 UMI 分布的情况。

# 在 R 里
dim(tumor_data)  # 看看过滤前后的 spot 数量变化
summary(tumor_data$nFeature_RNA)
summary(tumor_data$percent.mt)

# 在 Python 里
print(adata.shape)
sc.pl.violin(adata, 'n_genes_by_counts')
sc.pl.violin(adata, 'pct_counts_mt')

如果过滤后 spot 数量骤减（比如超过了 20%），我建议你回头检查一下阈值是不是太严，或者组织切片本身有没有物理瑕疵。

4.7 整个章节关键点总结

🎯 核心记住：

过滤不是为了让数据变漂亮，而是剔除明显的技术噪声。

三个关键指标：总 UMI、基因数量、线粒体占比。

阈值不准教条，必须看数据分布。

始终画图确认过滤前后差异。