📚 课程目录第1章 Spot质量控制概述

空间转录组学：从切片到Spot

各位同学，我是做空间转录组质控的老工程师。今天咱们聊聊这个领域的基础——你得先知道数据是怎么来的，才能知道它会在哪儿出问题。

空间转录组学，说白了，就是把传统RNA测序和细胞在组织里的物理位置绑在一起。你想想看，以前我们做Bulk或单细胞测序，细胞被打碎了，位置信息全丢了。而空间转录组，能告诉你某个基因在组织的哪个区域表达。这个信息对肿瘤微环境、神经发育、疾病病理来说，简直是救命稻草。

Spot，可以理解成一个捕获点。每个Spot覆盖几十到几百个细胞，具体看平台分辨率。10x Visium的Spot直径约55μm，相邻Spot中心距100μm，每个Spot通常捕获1-20个细胞。Slide-seq的Spot更小，直径2μm，能接近单细胞分辨率。

我个人习惯把Spot看作是像素点。只不过这个像素点记录的不仅是颜色，而是成千上万个基因的表达量。一个标准10x Visium捕获区域有约5000个Spot，每个Spot产生一个基因表达向量。

  关键点： Spot的质量决定了后续分析的可信度。低质量的Spot就像模糊的像素——你看不清图，更别说做精细分析了。

我遇到过不少项目，数据跑完一看，UMI计数分布严重偏斜——有些Spot只有几十个UMI，有些却高达上万个。嗯，这种数据不加质控直接分析，结果基本是废的。

目前主流空间转录组平台，各有各的脾气。我整理了一个表格，方便你对比：

平台	分辨率	Spot直径	捕获原理	关键局限
10x Visium	~55μm	55μm	载玻片上带空间条形码的捕获探针	分辨率低，一个Spot混合多个细胞
Slide-seq V2	~10μm	2μm	磁珠阵列，每个磁珠有唯一条形码	基因检测灵敏度低于10x
Visium HD	~2μm	2μm	高密度探针阵列	通量较低，分析软件还不成熟
MERFISH	单细胞级	亚细胞	多重荧光原位杂交	探针设计复杂，靶向基因数受限
Slide-tags	单细胞级	~10μm	组织切片与条形码磁珠共孵育后单细胞测序	需要解离步骤，可能丢失空间连续性

从我处理过的项目来看，10x Visium是社区最普及的——数据量大、工具链成熟。但你要是做过几个项目就会发现，它的Spot质量差异非常大。比如组织边缘的Spot，因为切片不完整或组织折叠，经常出现UMI极低的情况。另一个常见问题是组织内气泡——会在Spot间形成连续的低表达区域。

下面这张图是我画的流程概览，你们看看整体流程：

避坑指南： 我曾经有一个项目，第②步透化时间没控制好，导致RNA扩散到相邻Spot，结果下游聚类时出现了“幽灵表达”模式——看起来像是一个细胞群，实际上是扩散污染。质量控制一定要检查RNA扩散指数。

说白了，空间转录组数据的噪音来源比普通转录组多得多：

这些噪音如果不剔除，下游的空间聚类、差异表达、配体-受体互作分析都会跑偏。我亲眼见过一个案例：某团队没做Spot质控，直接看空间热点基因，结果鉴定出的“肿瘤边界marker”其实是切片边缘的低质量伪影——浪费了三个月验证时间。

注意： 质控不是“扔掉不好的数据”那么简单。你需要区分是真正的生物信号弱（比如组织致密区域），还是技术噪音（比如气泡、组织折叠）。盲目剔除可能导致丢失有生物学意义的区域，比如肿瘤的坏死核心本身RNA含量就低。

在接下来的29章里，我会带你们挨个攻克Spot质控的各个环节：

好了，这一章主要帮你建立整体认识。后续我们会逐步深入每一个技术细节。记住一个原则：一个坏Spot带来的错误，比一百个好Spot带来的信号更顽固。