数据预处理：过滤、标准化、归一化

数据预处理这一步，我把它叫做“洗菜切菜”。说白了，原始数据拿到手，不能直接下锅炒。你得先把烂叶子摘掉，把泥洗干净，再切得大小均匀。Giotto 处理空间转录组数据也一样——过滤、标准化、归一化这三个动作，决定了你后面所有分析的质量。

我个人习惯，拿到表达矩阵和空间位置信息后，第一件事不是跑算法，而是先看一眼数据长什么样。你想想看，如果几千个基因在大部分 spot 里都是零，这种数据不做处理直接去跑聚类，结果很可能会跑偏。

第一步：质量控制与过滤

过滤的目标很明确——把质量差的细胞/spot 和表达不可靠的基因剔除掉。我曾经在一个项目中，拿着别人处理好的数据直接复现，结果聚类图谱一塌糊涂。后来回过头去查原始 QC，发现不少 spot 的 UMI 计数只有几十，明显是空 spot 或死细胞。白白浪费了两天时间。

Giotto 里常用的过滤参数，我列了个表，你可以对照着看：

过滤类型 常用参数 说明 我的建议阈值
基因过滤 min_genes, max_genes 剔除检测基因数过少或过多的 spot min_genes=200, max_genes=5000
UMI 过滤 min_umis, max_umis 剔除总 UMI 计数异常的 spot min_umis=500, max_umis=20000
线粒体比例 mito_prefix, mito_threshold 剔除线粒体基因占比高的死细胞 mito_prefix="MT-", mito_threshold=0.2
基因表达率 min_cells 剔除只在极少数 spot 中表达的基因 min_cells=3
注意：过滤阈值不是死数字。不同平台（10X Visium vs. Slide-seq）的数据质量差异很大。我建议你先做一轮探索性过滤，观察数据分布，再调参数。上来就套用别人的阈值，容易把有用的信号也剔掉。

在 Giotto 里，过滤操作其实就几行代码：

# 创建 Giotto 对象
gobject <- createGiottoObject(
    expression = raw_expr_matrix,
    spatial_locs = spatial_locs_df
)

# 过滤 spot：剔除低质量细胞
gobject <- filterGiotto(
    gobject,
    min_genes = 200,
    min_umis = 500,
    max_umis = 20000,
    mito_threshold = 0.2
)

# 过滤基因：剔除表达量太稀疏的基因
gobject <- filterGiotto(
    gobject,
    min_cells = 3
)

嗯，这里要注意filterGiotto默认是按顺序执行的。你先过滤了 spot，再过滤基因，这样保留下来的基因集合才可靠。反过来先过滤基因再过滤 spot，逻辑上也没问题，但计算效率会差一些。

第二步：标准化——消除技术偏差

标准化解决的是“不同 spot 之间测序深度不一致”的问题。说白了，一个 spot 测到 1000 个 UMI，另一个 spot 测到 10000 个 UMI，不代表后者基因表达量真的高了 10 倍。可能只是那个 spot 捕获效率更高。标准化就是把这些技术差异抹平。

Giotto 支持多种标准化方法。我做过对比测试，不同方法对下游结果影响不小，尤其是在鉴定稀有细胞类型时。你选的方法不对，可能直接就把那 1% 的细胞群给淹没了。

方法 原理 适用场景 Giotto 参数名
library_size 除以总 UMI，乘以尺度因子 通用场景，计算快 method = "library_size"
log2 library_size 后取 log2 适合下游使用正态分布模型 method = "log2"
pearson 基于 Pearson 残差标准化 高 dropout 数据，保留低表达基因 method = "pearson"
rank 将表达量转为秩次 非参数检验、鲁棒性要求高时 method = "rank"
我的经验：如果数据质量好、测序深度均匀，用 log2 就够。如果数据比较“脏”——比如有 batch effect 或者 dropout 率很高——我会优先试 pearson。它能在保留真实生物信号的同时，更好地抑制技术噪声。

标准化代码也很直接：

# 方法一：library_size + log2
gobject <- normalizeGiotto(
    gobject,
    method = "log2",
    scale_factor = 10000
)

# 方法二：Pearson 残差标准化
gobject <- normalizeGiotto(
    gobject,
    method = "pearson"
)

我记得早期做 scRNA-seq 时，大家几乎清一色用 log2。后来空间转录组兴起，dropout 率比单细胞还高，pearson 标准化才逐渐被大家接受。你想想看，一个 spot 里可能只有 50% 的基因被检测到，剩下的全是零。这种情况用 log2 做标准化，那些未被检测到的基因并不是“真的不表达”——只是没被捕获到而已。

第三步：归一化——让数据落在同一量纲

标准化之后，数据量纲还是基因级别的（每个基因有自己的表达范围）。归一化是把所有基因拉到同一个尺度上，比如均值为0、方差为1。这不影响基因之间的相对关系，但能让你在用 PCA、UMAP 这些降维方法时，不被高表达基因“带偏”。

Giotto 的归一化默认就是 Z-score（标准分数）。你基本不需要自己调参数，不过我还是习惯看一眼归一化后的分布直方图，确保没有异常值。

# 归一化（默认 Z-score）
gobject <- adjustGiotto(
    gobject,
    method = "zscore"
)

# 你也可以手动控制哪些维度做归一化
gobject <- adjustGiotto(
    gobject,
    method = "zscore",
    vars_to_regress = c("total_umis", "percent_mito")
)

归一化的另一个作用，是帮你把不想看到的技术变量“回归掉”。比如总 UMI 数和线粒体比例，它们虽然已经在过滤时被控制，但残留的影响仍然存在。通过 vars_to_regress 参数，你可以把它们作为一个协变量移除。我经常在项目里做这一步，尤其是当组织样本里有坏死区域时——坏死区域的线粒体比例会偏高，不回归掉的话，后续聚类可能会把坏死和正常组织区分成两个独立的细胞群。

避坑指南：我曾经在一个项目中，看着聚类结果怎么都不对——某个区域明明是同一种细胞类型，硬是被分成了两群。查了半天，原来是标准化用的 scale_factor 设成了 1000 而不是默认的 10000，导致高表达基因的权重被放大。后来改成 10000 重新跑，问题就解决了。所以，参数一定要做 double check。

现在，我们用一张图来梳理整个预处理流程：

数据预处理流程 原始表达矩阵 + 空间位置 过滤（QC） 剔除：低UMI、异常基因数 高线粒体比例、稀表达基因 标准化 方法：log2、pearson、rank 消除测序深度差异 归一化（Z-score） 均值为0，方差为1 可回归技术协变量 预处理后表达矩阵

预处理做完，你的 Giotto 对象里会新增两个矩阵：一个叫normalized_expr（标准化后的表达量），一个叫scaled_expr（归一化后的表达量）。这两个矩阵是后续降维、聚类、可视化操作的基础。

最后再啰嗦一句：我建议你把过滤前后的数据统计量打印出来，保存成日志。这一步不花时间，但在你回头检查结果或者写论文时，能省去很多重复劳动。

# 查看预处理前后的数据量
print(dim(raw_expr_matrix))
print(dim(gobject@expression$raw$expr))

# 打印过滤统计
print(gobject@filter_stats)
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