3. FASTQ文件质量评估：FastQC的原理、运行与结果解读

拿到FASTQ文件之后，第一件事是什么？我个人习惯，不是急着比对，而是先跑一遍FastQC。这就像做饭之前先看看食材新不新鲜——如果数据本身有问题，后面的分析都是白搭。

FastQC是干啥的？说白了，它就是给测序数据做“体检”的。它会告诉你每条read的质量怎么样、GC含量正不正常、有没有接头污染、有没有过表达序列……这些指标直接决定了你的数据能不能用、怎么用。

我曾经在一次RNA-seq项目中，拿到数据就跑下游分析，结果差异基因怎么都调不出来。后来回头一看，FastQC报告里明明标了“接头污染严重”——嗯，从那以后我再也不跳过快检了。

3.1 FastQC核心原理

FastQC的工作方式其实挺直观的。它逐条读取FASTQ文件，把每个碱基的质量分数、GC含量、序列长度、重复率等信息统计出来，然后汇总成一份HTML报告。

它的核心逻辑可以用一句话概括：

• 读取FASTQ —— 逐条处理，不修改原文件
• 统计指标 —— 质量分布、碱基组成、GC含量、N比例、长度分布、重复序列、过表达序列、接头污染
• 生成报告 —— 每个指标都配了图，还给了“通过/警告/失败”的评判

评判标准呢？FastQC内置了一套阈值：

3.2 运行FastQC

安装FastQC很简单。我用的是conda环境：

conda install -c bioconda fastqc

运行方式也够直接：

fastqc sample1.fastq.gz -o ./qc_output

-o参数指定输出目录，不加的话报告就生成在当前目录。如果你想一次跑多个样本：

fastqc sample1.fastq.gz sample2.fastq.gz sample3.fastq.gz -o ./qc_output -t 4

-t是线程数，我通常设成4~8，看服务器核心数。你想想看，如果一个样本跑5分钟，32个样本用单线程跑就得两个半小时——用16线程，十几分钟搞定。

还有几个有用的参数：

• --extract：同时解压zip报告（默认不解压）
• --nogroup：关闭碱基位置分组，查看每个位置的详细质量（但报告会变大）
• --contaminants：指定污染序列文件，自定义检测

曾经有一次，我跑FastQC发现大量序列被标记为“overrepresented”，但查来查去不是接头。后来用--contaminants指定了自己建的污染序列库，发现是实验室的质粒污染——嗯，那次之后我再也不用默认的污染检测了。

3.3 结果解读实战

FastQC会生成两个文件：一个HTML报告和一个zip压缩包。解压后能看到每项指标的原始数据和图表。下面我挑几个核心模块，讲讲怎么看、怎么判断。

3.3.1 Per base quality （每个碱基位置的质量）

这个图是箱线图，横轴是read上的位置，纵轴是Phred质量分数。红线是中位数，蓝线是均值，黄色箱体是四分位距。

正常的数据长这样：前面质量高（Q > 30），后面慢慢下降，但始终保持在Q20以上。

如果看到了什么？

• 整体下降趋势明显：说明测序试剂消耗严重，建议从尾部截断
• 开头几个位置质量特低：可能是测序仪启动的不稳定，或者引物残留
• 中间突然掉质量：这个我遇到过，一般是某个循环出了问题

3.3.2 Per sequence quality （每条序列的平均质量）

这个图展示的是每条read的平均质量分布。横轴是平均质量，纵轴是read数量。理想的图应该是单峰，峰值在高质量区（Q28~Q40）。

我看这个图有个习惯——如果峰值偏左（Q20附近）或者出现双峰，就要警惕了。双峰往往意味着混入了不同来源的数据，或者测序过程出了岔子。

3.3.3 GC content （GC含量分布）

这个模块很有意思。理论上，基因组DNA的GC含量应该呈正态分布，峰的位置由物种决定。比如人类的GC含量约41%，大肠杆菌约50%。

但有时候你会看到：

• 多峰：可能是不同物种混在一起，或者有污染
• 峰型偏窄：可能是PCR扩增不均匀，或者测序有偏好
• 峰型宽但偏左/偏右：要考虑是不是有AT-rich或GC-rich序列大量的存在

我个人经验是，如果GC分布图和理论值差异太大，先别急着说污染，看看是不是文库构建时用了特定扩增方法——我做过一次全基因组扩增，GC分布就是歪的，但那并不代表数据不能用。

3.3.4 N content （N碱基比例）

N就是测序仪无法确定的碱基。如果某个位置N比例超过10%，那这个位置基本就是废的。全序列平均N比例一般不超过1%，多了就是测序质量差。

3.3.5 Sequence duplication levels （序列重复水平）

这图的横轴是重复次数，纵轴是序列占比。对于RNA-seq来说，高重复是正常的（高表达基因）。但对于DNA-seq来说，重复率过高就要考虑是不是PCR扩增偏好了。

怎么区分？我的经验是：

• 全是单峰低重复：正常DNA-seq
• 尾部明显抬升：可能有PCR重复
• 整体偏高且均匀分布：可能是文库复杂度不够

3.3.6 Adapter content （接头含量）

这个模块检测的是常见的Illumina接头序列。如果接头含量超过1%，FastQC会直接标红。这时候就得用cutadapt或Trimmomatic去接头了。我曾经对接一个肿瘤WGS数据，接头含量竟然标到15%——后来发现是文库制备时双端接头的ratio没调好。

3.3.7 Overrepresented sequences （过表达序列）

这个模块会列出出现频率异常高的序列。在RNA-seq里，过表达序列可能是rRNA残留；在WGS里，可能是线粒体DNA大量富集。FastQC还会尝试匹配这些序列是否为已知的接头、引物或污染序列。

3.4 批量分析与报告汇总

跑完所有样本之后，手动翻几十份HTML报告太低效了。我的习惯是用MultiQC汇总所有FastQC结果：

multiqc ./qc_output --interactive

MultiQC会把所有样本的FastQC报告合并成一份交互式HTML，一个页面就能对比所有样本的质量。哪几个样本有问题、哪个模块标红了，一目了然。

记得有一次，我拿着22个肿瘤样本的MultiQC报告去开组会，老板看了一眼就说：“第三号样本质量明显不行，你们是不是搞混了？”——回去一查，果然是文库编号错了。要不怎么说数据质控不能省呢。