3. 组学数据预处理与标准化工程

多组学药物重定位分析的第一步，不是建模，而是把来自转录组、蛋白质组、代谢组等不同平台的原始测量值，转换成彼此可比、可联合分析的数值空间。不同平台产生的数据在量纲、动态范围、缺失机制和批次效应上差异极大：RNA-seq 的原始 read count 受基因长度和测序深度双重影响，质谱蛋白质组的 LFQ 强度跨越 5～6 个数量级，代谢组峰强度则同时受离子化效率和上样量波动影响。如果直接把这些数值拼接进同一个特征矩阵，后续的相似性度量、网络推断和重定位打分都会被量纲主导，得到看似显著却不可复现的结论。本节围绕归一化、对数转换、缺失值插补、离群样本检测四个核心环节，给出可落地的处理逻辑与自动化脚本设计思路。

一、归一化：先消除技术性尺度差异

转录组层面最常用的是 TPM 与 FPKM。两者都先按基因长度归一化，再按测序深度归一化，区别在于归一化的顺序：FPKM 先除以基因长度（kb）再除以总测序深度（百万 reads），TPM 则先除以基因长度得到 rate，再除以所有 rate 之和并乘以 10⁶。这一顺序差异导致同一基因在两种度量下的数值不同，但 TPM 的每个样本总和恒为 10⁶，样本间可比性更好，因此跨样本比较优先使用 TPM。示例：某基因 count 为 2000，长度 2 kb，样本总 count 为 4×10⁷，则 FPKM ≈ (2000/2)/(40) = 25；若该样本所有基因 rate 之和为 8×10⁵，则 TPM ≈ (1000/8×10⁵)×10⁶ = 1250。数值不同，但排序关系一致。

蛋白质组 LFQ 强度通常先做 log2 转换，再按样本中位数或总强度归一化，以校正上样量和离子化效率差异。代谢组峰强度则常用中位数归一化、概率商归一化（PQN）或内标归一化。PQN 的核心是：先计算每个代谢物在所有样本中的中位数作为参考谱，再对每个样本求其与参考谱的比值中位数作为校正因子，最后用该因子除原始强度。相比简单中位数归一化，PQN 对样本中大量不变代谢物更稳健。

二、对数转换：压缩动态范围、稳定方差

对数转换不是可选项，而是多数组学数据的默认前置步骤。log2 转换能把乘性误差转为加性误差，使高丰度特征不再主导距离计算，同时让近似对数正态的分布更接近对称。转录组 TPM 通常做 log2(TPM+1)，加 1 是为了避免零值取对数无定义；蛋白质组 LFQ 强度一般直接 log2，因为质谱强度本身已是正值且很少为零；代谢组峰强度在归一化后同样建议 log2 或 log10。需要注意：对数转换应在归一化之后、插补之前进行，否则插补值会被量纲扭曲。

三、缺失值插补：区分机制再选方法

缺失值处理的关键是先判断缺失机制。转录组中的零值多为真实低表达或未检出，属于“生物学零”；蛋白质组和代谢组中的缺失则常分为两类：完全随机缺失（MCAR）和低丰度导致的随机缺失（MNAR）。对 MNAR，简单用均值或中位数插补会系统性高估低丰度特征，推荐使用下限插补，例如用该特征最小观测值的 1/5 或全局最小值的 0.2 倍填充。对 MCAR，可用 KNN 或随机森林插补，利用特征间相关性恢复缺失值。实践中建议：缺失率 > 50% 的特征直接剔除；缺失率 20%～50% 的特征用下限插补并标记；缺失率 < 20% 的特征用 KNN 插补。所有插补决策必须记录在日志中，便于复现。

四、离群样本检测：多指标交叉判断

离群样本会严重拉偏后续的差异分析和网络推断。建议同时观察三类指标：一是样本间相关性热图，若某样本与其余样本的 Pearson 相关系数中位数低于 0.8，需警惕；二是 PCA 或 UMAP 投影，若某样本远离同类样本簇超过 3 倍四分位距，视为候选离群；三是层次聚类树，若某样本在很早就单独分叉，也提示异常。三类指标中至少两类同时报警，才判定为离群并考虑剔除。剔除前应回溯原始数据，确认是否为批次、降解或标注错误，而非真实生物学变异。

五、标准化流程自动化脚本设计

把上述步骤固化为脚本，是保证多组学重定位分析可复现的关键。脚本应遵循“配置驱动 + 分步执行 + 日志留痕”的原则。下面给出一个 Python 脚本骨架，使用 YAML 配置文件描述每个组学的处理参数，主流程按组学类型分派到对应处理函数。

# config.yaml
transcriptome:
  input: "data/rna_counts.csv"
  normalize: "tpm"
  gene_length_col: "length"
  log: "log2_tpm_plus1"
  missing:
    drop_threshold: 0.5
    impute: "knn"
    knn_k: 10
proteome:
  input: "data/protein_lfq.csv"
  normalize: "median"
  log: "log2"
  missing:
    drop_threshold: 0.5
    impute: "min_factor"
    min_factor: 0.2
metabolome:
  input: "data/metab_peak.csv"
  normalize: "pqn"
  log: "log2"
  missing:
    drop_threshold: 0.5
    impute: "knn"
    knn_k: 5
outlier:
  corr_threshold: 0.8
  pca_mad: 3
  min_votes: 2

主脚本读取配置后，依次执行：加载矩阵 → 按组学类型归一化 → 对数转换 → 缺失率过滤与插补 → 合并为统一特征矩阵 → 离群样本检测 → 输出标准化矩阵与日志。每一步都写入 preprocess.log，记录样本数、特征数、缺失率、插补方法、离群判定结果。这样，当后续重定位结果出现异常时，可以快速定位是归一化参数、插补策略还是样本剔除导致的。

完成上述流程后，得到的标准化矩阵应满足：各样本整体分布对齐、特征动态范围压缩、缺失值有明确处理记录、离群样本有判定依据。这份矩阵才是后续差异分析、共表达网络和药物重定位打分的可靠输入。工程上，建议把该脚本封装为可配置的 CLI 工具，支持 --config 指定配置文件、--dry-run 仅检查数据质量、--report 输出 HTML 质量报告，使预处理环节从一次性代码升级为可复用、可审计的标准化组件。