📚 课程目录第2章结构数据获取与质量控制

2. 结构数据获取与质量控制

结构比对的第一步不是打开比对软件，而是把“要比什么”这件事在数据层面确定下来。同一个蛋白可能同时存在多条实验结构、多个预测模型、若干冷冻电镜密度图，它们的分辨率、覆盖范围、配体状态和链组成各不相同。若不加筛选就把第一个搜索结果丢进比对流程，后续的 RMSD、TM-score 或结合口袋分析都可能建立在不可比的对象上。本节围绕三类主流来源——PDB、AlphaFold DB、EMDB——说明如何取数、如何选链、如何识别缺失残基，以及如何用分辨率与 B 因子判断结构可信区间。

三类来源的定位与取数方式

PDB 是实验测定结构的归档库，条目来自 X 射线晶体学、冷冻电镜（cryo-EM）、NMR 等方法，每个条目以 4 位字符标识（如 1A2B），包含坐标文件（.cif/.pdb）、序列、配体、金属离子、水分子及实验元数据。取数时优先使用 mmCIF 格式，因为它能完整保留多模型、多链和化学修饰信息。AlphaFold DB 提供的是计算预测模型，按 UniProt 登录号组织，每个条目给出 pLDDT 逐残基置信度，适合在没有实验结构或需要覆盖全长时使用。EMDB 存放的是电镜密度图（.map/.mrc），本身不含原子坐标，通常与 PDB 中对应的电镜条目配套使用，用于验证坐标是否与密度吻合。

实际取数可以用命令行完成，便于批量与可复现：

# 从 PDB 下载 mmCIF 坐标与元数据
wget https://files.rcsb.org/download/1A2B.cif
wget https://files.rcsb.org/download/1A2B.xml

# 从 AlphaFold DB 下载预测模型与 pLDDT
wget https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-P00533-F1-model_v4.pdb
wget https://alphafold.ebi.ac.uk/files/AF-P00533-F1-model_v4.json

# 从 EMDB 下载密度图
wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/emdb/structures/EMD-1234/map/emd_1234.map.gz

下载后先看元数据再看坐标：PDB 的 XML 头里记录了分辨率、方法、R 因子、链列表和配体；AlphaFold 的 JSON 里记录了 pLDDT 分布和预测的 PAE 矩阵。先读元数据能避免在错误条目上做无用功。

链选择：先对齐生物学单元，再对齐序列

一个 PDB 条目常含多条链，例如同源二聚体 A/B、抗体轻重链 H/L、或晶体学不对称单元中的多个拷贝。链选择的核心判断是：要比对的是生物学相关单元，还是单个结构域？若研究二聚体界面，应保留成对链；若只比对一个激酶结构域，则只取包含该结构域的那条链，并确认其边界。

操作上，用 gemmi 或 Bio.PDB 读取链列表与残基范围，再按目标区域截取。例如用 Biopython 选择 A 链并只保留 50–300 号残基：

from Bio.PDB import MMCIFParser, PDBIO, Select

class DomainSelect(Select):
    def accept_chain(self, chain):
        return chain.id == "A"
    def accept_residue(self, residue):
        return 50 <= residue.id[1] <= 300

parser = MMCIFParser(QUIET=True)
structure = parser.get_structure("s", "1A2B.cif")
io = PDBIO()
io.set_structure(structure)
io.save("chainA_50_300.pdb", DomainSelect())

链选择还要注意编号体系：PDB 的残基编号可能从 1 开始，也可能沿用原始序列编号，甚至出现插入码（如 100A）。比对前必须把两条结构的编号统一到同一参考序列上，否则序列比对会错位。

缺失残基：看不见的部分不等于不存在

实验结构中常见“缺失残基”：柔性 loop、末端、被切割的标签在电子密度中不可见，因而坐标文件中没有对应原子。缺失分两种：一是坐标缺失但序列存在（用 REMARK 465 记录），二是序列本身不覆盖（如表达构建只含结构域）。前者影响比对覆盖度，后者影响序列一致性计算。

检查方法很直接：解析 mmCIF 的 _entity_poly.pdbx_seq_one_letter_code 得到完整序列，再与坐标中实际出现的残基列表做差集。若缺失集中在 loop 区，通常不影响核心比对；若缺失落在活性位点或界面，则该结构不适合用于功能推断。AlphaFold 模型一般覆盖全长，但低 pLDDT 区域（<70）在功能上同样应视为“不可信”，其作用与实验结构的缺失残基类似。

分辨率与 B 因子：判断可信区间

分辨率决定电子密度图的细节程度。经验上，X 射线结构优于 2.0 Å 可较可靠地放置侧链，2.0–3.0 Å 主链可信、侧链需谨慎，差于 3.5 Å 通常只能确定主链走向；cryo-EM 结构在 3–4 Å 区间常见，需结合局部密度判断。分辨率是全局指标，不能代表每个残基的质量，因此还要看 B 因子（温度因子）。

B 因子反映原子的热运动与位置不确定度，数值越高越不可信。判读时不要只看平均值，而应看分布：若某段 loop 的 B 因子显著高于全局均值（例如全局均值 35 Å²，而该段达 90 Å²），说明该区域坐标不可靠。AlphaFold 的 pLDDT 与 B 因子作用类似，可视为预测版的“置信度温度因子”，通常 >90 很可信、70–90 较可信、<50 应视为无序。

实操建议：把分辨率、R 因子、B 因子均值、缺失残基比例、pLDDT 均值整理成一张候选结构对照表，再决定用哪个条目进入比对。不要只凭分辨率高低做决定。

把筛选结果落成可复用的对照表

完成上述检查后，建议为每个候选结构记录一组固定字段，形成候选结构对照表，作为比对前的输入清单。字段应直接服务于“能否比、比哪段、结果可不可信”这三个问题：

条目	来源	方法	分辨率(Å)	选用链	残基范围	缺失残基	B因子/pLDDT均值	用途判断
1A2B	PDB	X-ray	1.8	A	50–300	12（loop 区）	28 Å²	核心比对，可信
3C4D	PDB	cryo-EM	3.6	A/B	60–290	35（含界面）	72 Å²	仅主链比对
AF-P00533-F1	AlphaFold	预测	—	A	1–320	0	pLDDT 86	补全缺失区，低置信段标注

表中“用途判断”一列是最终决策：分辨率与 B 因子共同决定该结构能支撑到什么程度的结论。若某条链的缺失残基恰好覆盖活性位点，即使分辨率很高，也不能用它来推断该位点的构象；此时可用 AlphaFold 模型补全，但必须把低 pLDDT 段明确标注为预测而非实验观测。

常见误区：把 AlphaFold 模型当作实验结构直接与 PDB 结构做严格叠合，并据此讨论侧链构象差异。预测模型的侧链在低 pLDDT 区并不可靠，比对时应以主链和可信区间为主，功能推断需回到实验证据。

完成取数、链选择、缺失残基核查与质量评估后，进入比对的结构对象才是“可比”的：编号统一、覆盖范围明确、可信区间有据可查。这一步做扎实，后续的比对算法选择与结果解释才有意义。