1. 蛋白突变稳定性预测工程导论
蛋白质突变稳定性预测，指的是在给定野生型蛋白序列与三维结构（或可用的结构模型）的前提下，判断某个氨基酸替换（例如 A42V）会使蛋白更稳定、更不稳定，还是几乎无影响，并尽可能给出可比较的定量变化量，常用 ΔΔG（以 kcal/mol 为单位）表示。工程化的含义在于：它不是一次性跑一个软件，而是把“输入准备—结构/序列处理—模型计算—结果校准—决策输出”组织成可重复、可批量、可追溯的流水线，让同一套流程能稳定地服务于成百上千个突变体。
本课程的核心问题可以归纳为四类。第一是表示问题：突变如何被编码成模型可读的特征，是仅用序列、仅用结构，还是序列+结构+进化信息联合表示。第二是计算问题：用什么物理或统计模型把特征映射为 ΔΔG，例如基于力场的能量项、基于统计势的接触项，或基于机器学习的回归模型。第三是校准问题：模型输出的原始分数与实验 ΔΔG 之间存在系统性偏差，需要用什么实验数据、以什么指标（如 Pearson r、Spearman ρ、RMSE、MAE）来评估和校正。第四是决策问题：预测结果如何转化为“保留哪些突变、优先做哪些实验”的工程判断，而不是停留在分数排序上。
为了把上述闭环讲清楚，先建立一张贯穿全课程的工程流程图。它描述的是数据与判断的流向，而不是软件菜单的操作顺序。
图中左侧是输入准备，中间是特征表示与稳定性计算，右侧是校准评估，下方是决策输出，虚线回路表示实验反馈。这个结构说明：预测工程不是“算一个分数”，而是把计算、校准和决策串成闭环。下面按这条主线展开关键内容。
输入准备：序列、结构与突变列表
输入准备决定了后续所有计算的上限。序列通常以 FASTA 格式给出，结构可以是实验解析的 PDB 文件，也可以是用 AlphaFold 等工具预测的模型。突变列表需要明确三点：野生型残基、突变位置、突变后残基，例如 A42V 表示第 42 位丙氨酸替换为缬氨酸。工程上建议统一使用“野生型单字母+位置+突变后单字母”的格式，并额外记录突变是否位于配体结合口袋、二硫键、金属配位位点等关键区域，因为这些位置的突变往往不能用通用模型可靠预测。
一个常见的教学示例是：目标蛋白为一段约 200 个残基的工业酶，野生型序列已知，结构分辨率为 1.8 Å，计划评估 50 个单点突变。此时输入清单应包含：野生型 PDB 编号、链标识、突变列表、每个突变位点的溶剂可及性（SASA）和二级结构类型。这些字段不是装饰，它们直接影响后续特征表示和结果解释。
特征表示：从序列与结构到模型可读的向量
特征表示是把生物对象翻译成数值向量的过程。常用特征包括：突变位点的相对溶剂可及性（RSA），用于判断残基是埋藏还是暴露；二级结构类型（α 螺旋、β 折叠、无规卷曲）；与突变位点空间距离小于 8 Å 的接触残基数量；以及基于多序列比对得到的保守性分数。保守性高的位点通常对突变更敏感，因为进化已经筛选过这些位置。
工程上要特别注意参照系的一致性。例如“埋藏度”可以定义为相对于三肽模型的最大可及性，也可以定义为相对于该残基在结构中的实际可及性，两者数值不同。课程中统一采用“RSA = 实际 SASA / 三肽最大 SASA”的定义，并在所有图表和代码中保持一致。如果切换到其他定义，必须明确说明。
稳定性计算：物理模型与数据驱动模型
稳定性计算的核心是估计突变前后自由能变化 ΔΔG = ΔG突变体 − ΔG野生型。按课程约定，ΔΔG 为负表示突变体更稳定，为正表示更不稳定。物理模型通常计算范德华力、静电作用、氢键、溶剂化能等能量项的变化；数据驱动模型则用已知实验 ΔΔG 数据训练回归器，输入是序列和结构特征。
以教学示例中的 A42V 为例，若该位点位于疏水核心，缬氨酸比丙氨酸体积更大，可能填补空腔从而稳定结构，预测 ΔΔG 可能为 −0.8 kcal/mol；若该位点位于表面且丙氨酸参与氢键，替换后氢键丢失，预测 ΔΔG 可能为 +1.2 kcal/mol。这些数值是示例性假设，用于说明正负号与稳定性的对应关系，不代表真实实验结果。
校准评估：用实验数据判断模型是否可信
校准是工程化预测中最容易被忽视的一环。模型输出的 ΔΔG 必须与实验测得的 ΔΔG 比较，常用指标包括 Pearson 相关系数 r、Spearman 秩相关系数 ρ、均方根误差 RMSE 和平均绝对误差 MAE。若 r 低于 0.5，说明模型只能粗略排序；若 RMSE 大于 1.5 kcal/mol，说明单点预测的绝对误差较大，不适合直接用于精细决策。
校准还包括系统性偏差修正。例如模型整体高估稳定性，可以拟合一个线性校正 ΔΔG_corrected = a × ΔΔG_pred + b，其中 a 和 b 由已知实验数据回归得到。校正后必须用独立测试集重新评估，避免过拟合。
决策输出：从分数到实验优先级
决策输出不是简单按 ΔΔG 排序，而是结合预测值、置信区间、突变位点重要性和实验成本，给出优先级。例如：预测 ΔΔG 小于 −1.0 kcal/mol 且位于非功能位点的突变，列为高优先级验证对象；预测 ΔΔG 在 −0.5 到 +0.5 kcal/mol 之间的突变，列为中性候选，可暂缓；预测 ΔΔG 大于 +1.0 kcal/mol 的突变，通常直接排除。对于多突变组合，还需要考虑上位性，即单个突变的效果之和与实际组合效果之间的偏差。