3. 序列比对基础与相似性度量

序列比对的核心任务，是在两条或多条蛋白质序列之间建立“谁和谁对应”的位置映射，并给出一个可比较的数值，用来判断它们是否同源、同源程度有多高。这个数值不是单一指标，而是由替换矩阵、空位罚分、一致性、相似度、E值、bit score等概念共同构成的度量体系。理解这些概念，关键不是背公式，而是理解它们在工程实现中各自承担什么角色。

替换矩阵：把氨基酸替换变成可累加的分值

蛋白质由20种氨基酸组成，不同氨基酸的理化性质不同，替换后对结构功能的影响也不同。替换矩阵就是一张20×20的查表，行和列分别代表两条序列在某个比对位置上的氨基酸，单元格中的数值表示“把A替换成B”这件事的得分。工程中最常用的是BLOSUM系列，例如BLOSUM62，它由大量保守区块统计得到，正值表示该替换在近缘序列中比随机更常见，负值表示更少见。

BLOSUM62中，相同氨基酸通常得正分，如W-W为11、C-C为9；性质相近的替换往往得0或小正分，如I-V为3、D-E为2；而性质差异大的替换常为负分，如W-C为-2、D-W为-4。矩阵还隐含一个前提：比对得分是逐位相加的。也就是说，一条比对的总原始分等于所有列得分之和，再加上空位罚分。这个“可加性”是后续所有统计量的基础。

空位罚分：处理插入与缺失的代价

两条同源序列常常发生插入或缺失，比对时必须在一条序列中引入空位。空位罚分决定“开一个空位”和“延长一个空位”各扣多少分。常见形式是仿射罚分：gap_open + (k-1) × gap_extend，其中k是空位长度。例如设置开位罚分-11、延伸罚分-1，则长度为3的空位总罚分为-11 + 2×(-1) = -13。

为什么开位罚分远大于延伸罚分？因为一次插入事件通常是一整段连续缺失，而不是多个独立单碱基事件。仿射罚分更符合生物学过程。工程上，罚分过小会导致比对中充斥碎片化空位，罚分过大则会把真实插入缺失压成错配。因此，替换矩阵和空位罚分必须成对调参，不能孤立看待。

一致性、相似度与原始分

一致性（identity）是最直观的指标：比对列中两条序列氨基酸完全相同的列数，除以比对总列数（含空位列）。例如100列中有35列相同，一致性为35%。相似度（similarity）则更宽松，只要替换矩阵中该列得分大于0，就认为“相似”。因此相似度通常高于一致性。两者都只是描述性统计，不能直接回答“这个比对是否显著”。

原始分（raw score）是逐列得分加空位罚分后的总和。它依赖矩阵和罚分设置，也依赖序列长度，因此不同参数下的原始分不可直接比较。工程实现中，原始分只是中间量，真正用于判断的是bit score和E值。

bit score与E值：把原始分变成可比较、可判断的量

BLAST等工具用Karlin-Altschul统计模型把原始分S转换为bit score：S' = (λS - lnK) / ln2。其中λ和K是由替换矩阵与空位罚分共同决定的统计参数。bit score的好处是去除了矩阵和罚分单位的影响，使不同参数、不同数据库的比对结果可以横向比较。bit score越高，比对越可信。

E值表示“在给定大小的数据库中，随机获得不低于当前bit score的比对数量的期望值”。公式为E = m × n × 2^(-S')，其中m为查询序列长度，n为数据库总残基数。E值越小越显著。工程上常用的判断阈值是E值小于1e-5，但这不是绝对标准：短序列、低复杂度区域、小数据库都会影响E值，需要结合一致性、覆盖度和结构域信息综合判断。

工程含义：参数必须成对调，判读必须多指标联合

在实际工程中，替换矩阵和空位罚分不是独立可调的旋钮。BLOSUM62配-11/-1是BLAST的常用默认组合，适合大多数近缘到中等远缘的蛋白比对；如果研究的是远缘同源，可换用BLOSUM45并适当降低罚分，让更多保守替换被接受；如果序列非常接近，BLOSUM80更合适。换矩阵后，λ和K随之改变，bit score和E值也会变化，因此不能拿不同参数下的E值直接比较。

另一个常见工程问题是低复杂度区域。富含A、S、P等单一氨基酸的片段，即使与随机序列比对也容易得到较高原始分，从而产生假阳性。标准做法是先用SEG或DUST等工具屏蔽低复杂度区，再执行比对。此外，短序列（如小于50个残基）的E值天然偏大，此时应更多依赖一致性、覆盖度和结构域注释，而不是死守E值阈值。

把这条度量链串起来：替换矩阵和空位罚分决定逐列得分，逐列得分累加得到原始分，原始分经λ、K转换为bit score，bit score结合序列长度和数据库大小得到E值，E值再与一致性、覆盖度一起支撑最终的同源判断。每一步都有明确的工程输入和输出，理解这条链，才能在参数调整和结果解读时不迷失方向。