3. 复合物序列与结构预处理

复合物结构预测的成败，往往在模型开始推理之前就已经被决定了。AlphaFold-Multimer、RoseTTAFold2、ColabFold 这类工具接收的并不是"几条 FASTA 序列"，而是一组经过严格对齐、编号一致、链身份明确的输入。如果直接把从 UniProt 或 PDB 下载的原始序列丢进预测流程，常见后果是：链间配对错位、MSA 深度虚高、模板残基编号与查询序列错位、缺失残基被当作真实残基参与建模。本节围绕四个预处理环节展开：多链序列比对、模板搜索、结构解析与缺失残基处理。

一、多链序列比对：从单链 MSA 到配对 MSA

单链预测时，MSA 只需保证同源序列与查询序列逐列对齐。复合物预测则要求不同链的 MSA 在物种层面"配对"——即同一行来自同一物种或同一基因组上下文，这样共进化信号才能反映链间接触。ColabFold 的 MMseqs2 流程默认对每条链独立搜索，然后按物种标签（taxonomy ID）进行配对；若无法配对，则退化为"未配对 MSA + 链间交叉配对"的拼接模式。

实际操作中，配对质量取决于两个参数：每条链的 MSA 深度（--max-seq，常用 512 或 1024）和配对后保留的行数（--max-paired）。以一条二聚体为例，若链 A 有 3000 条同源序列、链 B 有 800 条，配对后可能只剩 200 行左右。此时应检查配对率：低于 10% 通常意味着两条链的物种覆盖差异过大，需要考虑放宽 --db-load-mode 或改用未配对模式并显式增加链间交叉配对行数。

二、模板搜索：hhsearch 与结构模板的取舍

模板搜索的目标不是"找到最相似的结构"，而是找到与查询序列在链组成、化学计量比和界面几何上都兼容的结构。常用工具是 HHsearch（HHsuite）或 MMseqs2 的 profile 搜索。对复合物而言，模板必须同时覆盖多条链，否则只能作为单链模板使用。

一个可复现的 HHsearch 流程如下：先用 hhblits 为每条链生成 HMM profile，再用 hhsearch 将查询 profile 对 PDB70 数据库搜索，最后用 hhfilter 去冗余。关键参数包括 -e（E-value 阈值，常用 1e-3）、-cov（最小覆盖度，建议 ≥ 50%）、-qid（最小序列一致性，建议 ≥ 30%）。对于多链模板，还需检查模板中链的对应关系是否与查询一致——例如查询是 A-B 异源二聚体，模板却是 B-B 同源二聚体，则不能直接使用。

三、结构解析与缺失残基处理

当输入包含实验结构（如 PDB 文件）时，必须先解析并清理。PDB 文件中常见的三类问题：

• 缺失残基：晶体结构中柔性 loop 未解析，表现为残基编号跳号（如 45 后直接是 52）。
• 缺失原子：侧链原子缺失，常见于赖氨酸、精氨酸等长侧链。
• 非标准残基与修饰：MSE（硒代甲硫氨酸）、SEP（磷酸化丝氨酸）等，需映射回标准残基或显式保留。

处理缺失残基有三种策略：一是直接删除该残基，适用于远离界面的柔性区；二是用 MODELLER 或 PDBFixer 补全，适用于界面附近；三是保留为 gap，让预测工具自行处理。判断依据是缺失残基是否位于链间界面 8 Å 范围内——若在界面内，删除会显著改变界面几何，应优先补全。

# 使用 PDBFixer 补全缺失残基与原子
from pdbfixer import PDBFixer
from openmm.app import PDBFile

fixer = PDBFixer(filename='complex_raw.pdb')
fixer.findMissingResidues()
fixer.findMissingAtoms()
fixer.addMissingAtoms()
fixer.addMissingHydrogens(pH=7.0)
PDBFile.writeFile(fixer.topology, fixer.positions, open('complex_fixed.pdb','w'))

补全后必须做一致性检查：补全残基的 φ/ψ 是否落在 Ramachandran 允许区、补全区域是否与相邻链产生原子冲突（< 2.0 Å 视为冲突）。若冲突严重，应回退到删除策略并记录该区域为不确定区。

四、预处理结果的自检清单

完成上述三步后，建议用以下清单快速判断输入是否可用：

预处理不是一次性动作，而是与预测结果迭代的过程。第一轮预测后若发现界面残基置信度（pLDDT 或 PAE）异常低，应回到本节流程检查：该区域是否在模板中缺失、MSA 配对是否覆盖了该界面、补全残基是否引入了不合理构象。把预处理结果连同参数一起记录，才能在复现时定位问题来源。