2. 靶点选择与结构数据获取
靶点结构准备的第一步不是打开建模软件，而是把“目标蛋白”这件事在数据库层面说清楚。同一个蛋白名称，可能对应多个基因、多个物种、多个异构体、多个氨基酸编号体系；同一个 PDB 条目，可能只覆盖结构域的一部分，也可能带着一段融合标签或突变。若这些信息没有在检索阶段对齐，后续的序列比对、口袋分析和分子对接都会建立在错误的对象上。因此，本节的核心任务是：用 UniProt 确定“分析对象”，用 PDB 确定“实验结构”，用 AlphaFold DB 补齐“缺失覆盖”，再用一套可复核的指标判断这些结构是否足以支撑可成药位点分析。
一、先定对象：UniProt 条目是靶点的“主键”
检索应从 UniProt 开始。以人类表皮生长因子受体 EGFR 为例，在 UniProt 中检索 EGFR_HUMAN 可得到条目 P00533，它给出了规范序列、基因名、物种、异构体、跨膜区、结构域边界以及到 PDB、AlphaFold DB 的交叉引用。这里要特别关注三件事：规范序列（Canonical）、异构体（Isoform）和编号体系。很多下游工具默认使用 UniProt 规范序列编号，而 PDB 条目常使用成熟蛋白或构建体的独立编号，两者可能相差几十个残基。若不记录映射关系，后续说“第 790 位甲硫氨酸”时就会产生歧义。
实际操作中，建议在检索阶段就固定一份“靶点身份卡”，至少记录：UniProt AC、条目名、物种、规范序列长度、目标异构体、关键结构域区间、以及该条目关联的 PDB 与 AlphaFold 条目。这份卡片不需要复杂，但它是后续所有结构评估的基准。
二、再看实验结构：PDB 的覆盖度、分辨率与配体
PDB 提供的是实验解析结构，价值在于真实构象与配体信息，但它的局限同样明显：很多膜蛋白、大复合物或柔性区域没有实验结构。检索 PDB 时，不能只看“有没有条目”，而要逐条评估四个维度。
- 覆盖度：条目覆盖了目标序列的哪些区间。例如 EGFR 的激酶域约在 712–979 位，若某 PDB 条目只解析了 696–1022 中的部分残基，就要确认目标口袋是否落在覆盖范围内。
- 分辨率：X 射线与冷冻电镜结构通常以 Å 为单位给出分辨率。一般 1.5–2.5 Å 适合观察侧链与配体细节，3.0 Å 以上需谨慎判断侧链朝向与口袋形状。
- 配体信息：条目中是否含有目标配体、辅因子、金属离子或已知抑制剂。配体存在往往意味着该结构处于某种可成药的构象，对口袋分析极有价值。
- 物种差异：人源靶点应优先选择人源结构；若只有鼠源或其它物种结构，需要评估关键口袋残基是否保守，避免把物种差异误判为可成药性差异。
例如，若某激酶靶点的人源实验结构只覆盖了 ATP 结合口袋的一部分，而另一个鼠源结构覆盖完整但关键残基不同，就不能简单用鼠源结构替代。正确做法是：以人源序列为基准，比较关键残基是否一致，再决定是否使用该结构或改用 AlphaFold 模型。
三、补齐缺失：AlphaFold DB 的定位与使用边界
AlphaFold DB 为大量 UniProt 条目提供了预测模型，适合在实验结构缺失或覆盖不足时补齐。它的优势是覆盖完整、可直接按 UniProt 编号使用；局限是它给出的是预测构象，不包含配体，且对柔性区域、别构构象和膜环境的处理有限。因此，AlphaFold 模型更适合用于整体折叠评估、缺失区域补全和口袋初筛，而不应直接替代实验结构做高精度对接。
使用 AlphaFold 模型时，应关注每个残基的 pLDDT 置信度。通常 pLDDT > 90 表示高置信，70–90 为中等，低于 70 的区域往往柔性较大，不适合作为口袋判断依据。若目标口袋恰好落在低置信区，应优先寻找实验结构或考虑该区域本身是否稳定可成药。
四、把评估串起来：一张结构数据获取与评估关系图
下面这张图把“检索—评估—决策”的关键关系集中呈现：从 UniProt 确定对象，分别进入 PDB 与 AlphaFold DB 两条结构来源，再按覆盖度、分辨率、配体、物种差异和置信度进行判断，最终决定使用实验结构、预测模型，还是两者结合。
五、一个可复用的评估示例
假设目标是一个人类激酶靶点，UniProt 规范序列长 1200 个残基，目标口袋位于 700–850 区间。检索 PDB 得到三个条目：条目 A 分辨率 1.8 Å，覆盖 690–860，含一个抑制剂配体，人源；条目 B 分辨率 2.9 Å，覆盖 650–900，无配体，人源；条目 C 分辨率 2.0 Å，覆盖 700–850，含配体，但为鼠源。此时合理判断是：条目 A 最优先，因为覆盖目标口袋、分辨率好、有人源配体信息；条目 B 可作为构象参考，但分辨率偏低且无配体；条目 C 需先比较 700–850 区间关键残基是否与人源一致，若一致可作为补充，若不一致则不宜直接使用。若三个条目都未覆盖 850 之后的关键区域，则用 AlphaFold 模型补全，并检查该区域 pLDDT 是否足够。
六、检索与评估的最小检查清单
| 检查项 | 关键问题 | 判断依据 |
|---|---|---|
| 对象一致性 | UniProt 条目、物种、异构体是否明确 | AC 编号、规范序列、目标异构体 |
| 覆盖度 | 目标口袋是否落在解析或预测区间内 | 序列区间与结构域边界对齐 |
| 分辨率 | 是否足以判断侧链与口袋形状 | X 射线/冷冻电镜分辨率数值 |
| 配体信息 | 是否含目标配体或已知抑制剂 | PDB 配体列表与结合位点 |
| 物种差异 | 关键口袋残基是否保守 | 人源与其它物种序列比对 |
| 预测置信度 | AlphaFold 模型目标区域是否可靠 | pLDDT 数值分布 |
完成以上检索与评估后，才进入结构下载、清洗与标准化。此时应保留一份可追溯的记录：使用了哪个 UniProt 条目、哪些 PDB 条目、是否使用 AlphaFold 模型、编号体系如何映射、以及最终选择该结构的理由。这样在后续口袋分析或对接结果异常时，才能快速回到源头排查，而不是在错误的结构对象上反复调整参数。